Résumés des communications orales

Evaluation prospective de la contamination fongique dans deux services hospitaliers au cours d'un chantier de construction

 Sautour M.,^a Sixt N.,^c Dalle F.,^a,b L’Ollivier C.,^a Calinon C.,^a,c,e Fourquenet V.,^a,c,e Thibaut C.,^a Jury H.,^a Lafon I.,^d Aho S.,^e Couillault G.,^f Vagner O.,^a Cuisenier B.,^a Besancenot J.-P.,^g Caillot D.,^d Bonnin A.,^a,b

^a Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, ^c Microbiologie environnementale, ^e Unité d’hygiène hospitalière et d’épidémiologie- Hôpital du Bocage, BP 77908, 21079 Dijon Cedex, France

^b Laboratoire Interactions Muqueuses - Agents Transmissibles, ^g Laboratoire climat et santé - Faculté de Médecine, BP 87900, 21079 Dijon Cedex, France

^d Unité d’hématologie adulte, ^f Unité d’hématologie pédiatrique - Hôpital d’Enfants, BP 77908, 21079 Dijon Cedex, France

En milieu hospitalier, les travaux de démolition et de construction sont une source de remise en suspension de spores fongiques. Elles représentent un facteur de risque de mycose chez les patients immunodéprimés, hospitalisés à proximité des zones de travaux. Le CHU de Dijon s’est engagé début 2006 dans un important projet architectural, visant à regrouper sur un seul site l’ensemble des activités hospitalières. L’objectif a donc été d’évaluer, par une étude prospective de 18 mois, l’impact de ces activités de construction sur la contamination fongique environnementale au sein de deux unités d’hématologie (adulte et pédiatrique) localisées à proximité du chantier de construction. Les prélèvements d’air ont été réalisés à l’aide d’un biocollecteur Air-ideal (BioMérieux). L’analyse des résultats a montré une contamination aérienne moyenne de 4.2 cfu/m³ dans le service d’hématologie adulte et de 4.1 cfu/m³ en hématologie pédiatrique. Lorsque les travaux de construction ont débuté en janvier 2006, il a été mis en évidence une augmentation du nombre de spores fongiques dans l’air (de 3.0 à 9.8 cfu/m³) dans le service d’hématologie adulte. Cependant les concentrations en spores n’ont jamais excédé 10 cfu/m³ dans les deux unités pendant la totalité de la période d’étude. Les principaux mycètes identifiés à l’intérieur des 2 unités ont été Penicillium spp. (27 à 38%), Aspergillus spp. (25%), et Bjerkandera adusta (7 à 12%), et ces valeurs diffèrent radicalement des résultats obtenus à partir de prélèvements d’air extérieurs où Cladosporium spp. est largement le mycète prédominant (51% de la flore fongique totale). Ces résultats suggèrent un développement actif de micromycètes dans des niches écologiques privilégiées de l’environnement intérieur des infrastructures hospitalières.

Enfin nous avons évalué l’impact de l’utilisation de nouvelles unités mobiles de traitement de l’air (unités Plasmair^TM) en comparant les résultats de contamination fongique au sein de chambres équipées d’un Plasmair^TM et les résultats provenant de chambres non protégées. Il apparaît une différence très significative de la contamination au sein des chambres équipées d’une unité Plasmair^TM (4.3 cfu/m³) par rapport aux chambres sans système de traitement de l’air (14.3 cfu/m³).

 Quantification des moisissures de l’environnement domestique par  PCR en temps réel

Laurence millon¹, ANNE-PAULINE Bellanger¹, SANDRINE Roussel¹, EMELINE Didier¹, FREDERIC Grenouillet¹, JEAN-CHARLES Dalphin², RENAUD Piarroux¹, GABRIEL Reboux¹

¹Service de Parasitologie-Mycologie, ²Service de Pneumologie, CHU Besançon

laurence.millon@univ-fcomte.fr

 La présence de moisissures dans les logements a été associée à des pathologies de gravité variable, résultant de réactions allergiques ou toxiques (asthme, rhinites, syndrome des bâtiments malsains, hémosidérose, cancer). La relation dose/effet, par espèce et par pathologie n’est pas établie car la plupart des études ont utilisé des méthodes indirectes ou globales (humidité, odeur, moisissure visible) ou des méthodes d’examen direct et culture qui ne permettent pas de quantification précise. Notre objectif était de quantifier dans l’environnement domestique cinq espèces capables de produire des substances allergisantes et/ou des mycotoxines (Cladosporium sphaerospermum, Alternaria alternata, Penicilllium chrysogenum, Stachybotrys chartarum, Aspergillus versicolor) et une espèce capable de provoquer des infections chez les sujets immunodéprimés (Aspergillus fumigatus).

 110 logements appariés ont été inclus dans cette étude (30 logements insalubres, 25 logements de patients allergiques, 55 logements témoins appariés). Des prélèvements d’air sur filtre Teflon, et des prélèvements de surface par écouvillonnage ont été effectués dans la chambre et la salle de bain de chaque logement. L’extraction d’ADN a été réalisée à partir des liquides de rinçage des filtres et des écouvillons, à l’aide du kit High Pure PCR template (Roche diagnostic). L’ADN de C. sphaerospermum, A. alternata, A. versicolor, P chrysogenum, S. chartarum, A. fumigatus a été détecté par PCR en temps réel sur Light Cycler en utilisant les systèmes d’amorces et sondes décrits par Haughland et coll*.

 Par rapport à leur témoin, les logements insalubres ont montré dans les prélèvements d’air une concentration plus élevée en C. sphaerospermum (9590 vs 2863 eq-spore/m³ ; p<0 ,008), et dans les prélèvements de surface, des concentrations plus élevées en C. sphaerospermum (6,3x10⁷ vs 3x10⁷ eq-spore/25cm²; p<0,0001),  A.  versicolor (44 162 vs 22 eq-spore/25cm² ; p<0,0001) et P. chrysogenum  (2778 vs 1 eq-spore/25cm² ; p<0,0001).

Les logements de patients allergiques ont montré dans les prélèvements d’air des concentrations plus élevées en A. versicolor (68 vs 11 eq-spore/m³; p<0,04), et dans les prélèvements de surface, des concentrations plus élevées en C. sphaerospermum (1,6x10⁷ vs 5,8x10⁵ eq-spore/25cm² ; p<0,008), et  A. versicolor (80 vs 2 eq-spore/25cm² ; p< 0,004).

S. chartarum a été détecté dans les prélèvements de surface de10 logements insalubres, 7 logements de patients allergiques et 4 logements témoins.

 La quantification par PCR en temps réel dans les prélèvements d’air de  C. sphaerospermum représente une mesure simple et objective permettant de caractériser les logements insalubres. L’étude doit être poursuivie sur un nombre supérieur de logements afin d’établir un « seuil » d’insalubrité ; un recueil de données cliniques plus exhaustif permettra de préciser le rôle d’A. versicolor dans les pathologies allergiques.

« ECRAN HUMIDE ANTI-POUSSIERES » DANS LA PREVENTION DE L´ASPERGILLOSE AU COURS DE TRAVAUX : PRESENTATION DU DISPOSITIF ET EVALUATION ENVIRONNEMENTALE A L´HOPITAL COCHIN.

M THÉRÈSE BAIXENCH^1-2, P POIRIER¹, EMILIE BRISELET¹, ANGELA DAL FARRA², C VINSONNEAU³, A PAUGAM¹, H BLANCHARD², J DUPOUY-CAMET¹

¹Service de Parasitologie-Mycologie ; ²Unité d´hygiène hospitalière ; ³CLLIN

Groupe hospitalier Cochin Saint Vincent de Paul

27, rue du faubourg Saint Jacques 75679 Paris Cedex 14

marie-therese.baixench@cch.aphp.fr

 Principe de l´écran humide anti-poussières (EAP) : l´objectif est de produire un aérosol d´eau sur la périphérie du chantier et en hauteur facilitant la capture des poussières projetées sur un filet anti-poussières. Ce dispositif, non évalué à ce jour, a été installé autour de 2 chantiers sur les sites Cochin et Port Royal.

Evaluation environnementale : des prélèvements d´air ont été effectués à l’extérieur du chantier et à l´intérieur des bâtiments exposés.

 Résultats :

- Site Cochin : un EAP a été installé durant les périodes de démolitions et d´excavations. Autour du chantier, une augmentation des concentrations fongiques totales a été observée au cours de ces  2 périodes : elle a été non significative pendant les démolitions (médiane : 34 spores/m³ -  période de référence : 26 spores/m³) ; elle a été plus importante au cours de la période d´excavations (médiane : 55 spores/m³ ; p<0,01) ; cette période a été émaillée par des dysfonctionnements de l´EAP.

A l´intérieur des bâtiments, une augmentation significative de l´aéropollution fongique au cours des 2 périodes a été mise en évidence (médianes de 31 à 81 spores/m³ ; période de référence : 16 à 19 spores/m³ ; p<0,01). Il n´a pas été observé d´augmentation des concentrations aspergillaires.

- Site Port Royal : l´EAP a été installé uniquement au cours des démolitions. Durant cette période, les concentrations fongiques totales sont restées basses à l´extérieur et à l´intérieur du bâtiment (médianes respectives : 12 et 16 spores/m³).

La surveillance épidémiologique n´a pas montré une augmentation de l´incidence de l´aspergillose invasive à l´hôpital.

 Discussion : L´interprétation des résultats environnementaux est plurifactorielle (saisons, météo, configuration des chantiers,…). Ce travail montre que la mise en place d´un EAP ne permet pas toujours de contrôler entièrement l´empoussièrement généré par un chantier ;  l´EAP doit être associé aux mesures de prévention du risque aspergillaire habituellement préconisées dans les chantiers et les unités de soins. Il apparaît néanmoins comme un moyen complémentaire dans la prévention de l´aspergillose au cours de travaux à l´hôpital.

La confrontation des résultats et des expériences sur différents sites semble toutefois nécessaire pour conclure sur l´efficacité intrinsèque d´un EAP.

PRESENCE DE DEUX VARIANTS D’ASPERGILLUS FUMIGATUS DANS UNE CULTURE D’ABCES GANGLIONNAIRE CHEZ UNE PATIENTE IMMUNODEPRIMEE. A PROPOS D’UN CAS.

AGATHE LEBUISSON¹, MARIE-THERESE BAIXENCH¹, HELENE YERA¹, F.DREYFUS², A.PAUGAM¹, J. DUPOUY-CAMET¹

 1- Service de Parasitologie-Mycologie

2- Service d’Hématologie clinique

Groupe hospitalier Cochin Saint Vincent de Paul

27 rue du faubourg Saint Jacques

75679 Paris cedex 14

agathe.lebuisson@cch.aphp.fr

Une femme de 62 ans, ayant une maladie de Waldenström, est hospitalisée pour une fièvre évoluant depuis un mois et une adénopathie jugulo-carotidienne droite. Elle a reçu au cours des derniers mois plusieurs traitements immunosuppresseurs et une chimiothérapie. Le scanner thoraco-abdominal objective l’adénopathie, qui présente un centre nécrotique, et un nodule du sommet pulmonaire droit. Le ganglion est biopsié. La culture permet l’isolement de deux champignons filamenteux. L’un est vert et correspond à un A. fumigatus. L’autre est blanc, à sporulation lente. L’incubation prolongée (deux semaines) permet d’identifier un A. fumigatus. La biologie moléculaire (amplification et séquençage de la région ITS1-5,8S-ITS2) confirme l’espèce. Les repiquages successifs de la colonie blanche sur Sabouraud retrouvent toujours un variant blanc parmi les colonies vertes. Les CMI (amphotéricine B, voriconazole, posaconazole, itraconazole et caspofongine) pour les deux souches isolées sont basses (<0.38 µg/mL). La patiente est traitée par voriconazole. Le diagnostic d’aspergillose invasive n’a pas été retenu (la culture des crachats est négative et les antigènes aspergillaires successifs resteront négatifs). La patiente sera allogreffée trois mois après sous couvert d’une bithérapie par caspofongine et voriconazole sans complications.

Des variants blancs d’A. fumigatus ont déjà été décrits. Ils ont été isolés chez des patients traités par antifongiques. D’autres variants blancs, caractérisés par une sensibilité diminuée à la plupart des antifongiques, ont été récemment identifiés comme étant une espèce proche d’A. fumigatus. Ils ont été nommés A. lentulus (=qui sporule lentement).(1).

L’isolement d’un A. fumigatus blanc en culture est inhabituel. Les caractères phénotypiques ne permettant pas de les distinguer d’un A. lentulus, il est conseillé de réaliser systématiquement des CMI sur ce type de souche. 

1.         Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, Nickle D, Marr KA. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell 2005;4(3):625-32.

Diminution de l'incidence de l'Aspergillose Invasive Nosocomiale lors de la réalisation de travaux à risque élevé sur une période de 5 ans

 M.Nouvellon¹ , P.Etancelin¹, S. Silly ¹ , JC.Richard², JP.Vannier³, AM.Cardine³, I.Tiret⁴, V.Merle⁵  ,M.Nouvellon¹ et la cellule aspergillose du CHU de Rouen

¹Laboratoire Hygiène Hospitalière, ²Service de réanimation médicale, ³Service d'onco-hématologie pédiatrique, ⁴Département de Pharmacie, ⁵Unité de Prévention des Infections Nosocomiales, CHU Rouen, France

 Objectifs : Depuis 5 ans au sein de notre CHU de 2500 lits, de nombreux travaux ont été réalisés à l'intérieur ou aux abords des services d'hémato-oncologie pédiatrique (HOP) et de réanimation médicale adulte (RMA) (classés risque 3 à 5).

Le suivi de l'incidence de l'aspergillose invasive nosocomiale (AIN) a permis d'évaluer l'efficacité des mesures environnementales systématiques mises en place pour protéger les patients à risque. 

Méthodes : Les suspicions d'AIN ont été colligées à partir des ordonnances nominatives d'Amphotéricine B, voriconazole, caspofungine, dans les deux principaux services prescripteurs (RMA et HOP). Selon les critères de l'OMS, les cas ont été classés en possible, probable ou prouvé à partir des données cliniques, biologiques et radiologiques.

Les aspergilloses diagnostiquées à l'admission ont été écartées.

3 indicateurs ont été étudiés :

-l'incidence (I) de l'AIN, rapportée à 1000 jours d'hospitalisation.

-le risque relatif (RR) : la date de survenue des cas a été mise en parallèle avec les dates de réalisation des travaux

-la consommation en antifongiques en unités (CA)

Résultats : La cellule aspergillose, groupe de travail multidisciplinaire créé en 2002 conformément aux recommandations de l'HAS, a accompagné divers chantiers aux abords ou au sein des services : 5 en RMA soit 26 mois d'exposition aspergillaire dont 16 au risque 5 et 10 en HOP soit 28 mois d'exposition dont 2 au risque 5.

Sur les 99 dossiers étudiés en HOP,  36 cas ont été retenus comme AIN et sur les 93 dossiers de RMA, 19 cas ont été classés.

 

Service		2002	2003	2004	2005	2006
RMA	Nb de cas (N)	7	3	4	3	2
	I / 1000 j	1.12	0.48	0.8	0.5	0.34
	CA	621	180	746	356	244
HOP	N	7	4	6	13	6
	I / 1000 j	3.17	1.72	2.12	3.14	2.24
	CA	1295	446	591	2985	449

 

Malgré la réalisation de travaux, une diminution progressive des cas d'AIN est observée entre 2002 et 2006 corroborée par une diminution parallèle de la consommation des antifongiques dans les 2 services.

Les RR (0.69 en RMA et 0.73 en HOP) indiquent que les travaux ne sont pas un facteur d'augmentation de l'incidence de l'AIN et ce, sur 4 périodes de travaux de risque 5 étudiées.

Conclusion

Dans notre expérience et à plusieurs reprises, les travaux réalisés dans les services à risque ne sont pas accompagnés d'une recrudescence des cas d'AIN et ce, grâce à la mise en place de mesures préventives environnementales efficaces. Ceci permet un meilleur usage des antifongiques.

Développement d’un test ELISA pour le diagnostic de la maladie du poumon de fermier

Sandrine Roussel¹, Bénédicte Rognon¹, G. Reboux¹, M. Monod², F. Grenouillet¹, J-C Dalphin³, Laurence Millon¹.

 ¹ Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU Besançon.

² Service de Dermatologie, CHUV Lausanne.

³ Service de Pneumologie, CHU Besançon.

sandrine.roussel@univ-fcomte.fr

 La maladie du poumon de fermier (PDF) est une maladie pulmonaire liée à la pénétration jusqu’aux alvéoles de particules fongiques de diamètre <4 µm. Il a été démontré que les zones d’activité antigénique étaient différentes et variables en fonction du type de particule fongique considéré (conidies, ascospores ou filaments mycéliens). La composition fine des aérosols auxquels l’agriculteur est soumis est méconnue. Eurotium amstelodami (= Aspergillus hollandicus) est l’une des espèces responsables du PDF en Franche-Comté. L’objectif de cette étude était de comparer par ELISA différents types d’antigènes issus d’Eurotium amstelodami, et de déterminer l’antigène le plus performant pour le diagnostic sérologique de la maladie.

 Des antigènes ont été produits à partir de conidies, d’ascospores et de filaments d’Eurotium amstelodami. Ces 3 types d’antigènes ont été testés en ELISA avec les sérums de 10 agriculteurs atteints de PDF, 15 témoins exposés et 8 témoins non exposés. La quantité d’antigène par puit a été standardisée. Les sérums ont été déposés en triplet. La recherche d’un seuil permettant le meilleur compromis entre sensibilité et spécificité a été réalisée par la méthode des courbes ROC  (Receiver Operating Characteristic analysis).

La répétabilité des résultats est améliorée par l’utilisation d’antigènes purifiés de conidies et d’ascospores. L’antigène d’ascospores permet d’obtenir une meilleure discrimination entre les malades et les témoins exposés asymptomatiques que les deux autres types d’antigène. La sensibilité du test est de 70% pour une spécificité de 87%.

L’extrait antigénique purifié, isolé d’ascospores d’E. amstelodami permet une discrimination des sujets malades et des sujets exposés non malades par un test ELISA, plus simple et plus rapide à réaliser que les techniques de diffusion. Les performances du test ELISA pourront être améliorées par l’utilisation d’antigènes recombinants spécifiques des fractions protéiques de l’antigène d’ascospores, et par l’utilisation d’une combinaison d’antigènes issus de plusieurs micro-organismes.

ZYGOMYCOSE A CUNNINGHAMELLA BERTHOLLETIAE CHEZ UN ENFANT TRAITE POUR UNE LEUCEMIE AIGUE MYELOBLASTIQUE.

¹CLAIRE LACROIX, ²JULIETTE ANDREU-GALLIEN, ³ANNE BERGERON, ⁴D. GOSSOT, ²CECILE KERDUDO, ²B. BRETHON, ⁵E. DANNAOUI, ²T. LEBLANC, ²A. BARUCHEL, ¹MARTINE FEUILHADE.

¹Service de Mycologie-Parasitologie, ²Service d’Hématologie pédiatrique, ³Service de Pneumologie, Hôpital Saint Louis, APHP, ⁴Département thoracique, Institut Mutualiste Montsouris, ⁵Centre National de Référence des Mycoses et des Antifongiques, Institut Pasteur ; Paris.             claire.lacroix@sls.aphp.fr

 L’espèce Cunninghamella bertholletiae (Cb), seule représentante de ce genre en pathologie humaine, n’est que rarement responsable d’infection. Nous rapportons ici le cas d’une zygomycose pulmonaire à Cb chez un enfant atteint d’une leucémie aiguë myéloblastique. Cet enfant de 12 ans d’origine malienne né en France, n’ayant pas fait de séjour récent en Afrique, est pris en charge en juillet 2007 pour une leucémie aiguë myéloblastique. Une induction par mitoxantrone et cytarabine est débutée (J1). Une neutropénie (<0,1.10⁹/l) est présente dès le diagnostic et jusqu’à J32 post-chimiothérapie. Le patient présente une toux antérieure à son hospitalisation et la radiographie thoracique (J5) met en évidence une opacité péri-hilaire gauche. A J7 il devient fébrile et se plaint d’une douleur thoracique augmentant à l’inspiration. Une antibiothérapie large spectre est débutée. Le scanner thoracique (J8) montre une masse hilaire ainsi qu’une condensation alvéolaire postérobasale gauches. L’endoscopie bronchique avec lavage broncho-alvéolaire (J9) ne retrouve aucun microorganisme pathogène. L’amphotéricine B est alors débutée (1mg/kg/j). Elle est remplacée par l’amphotéricine B liposomale (3mg/kg/j) à J17 pour cause de mauvaise tolérance rénale. Devant la persistance de la fièvre, de la toux, de la douleur et la progression radiologique de la pneumopathie, un traitement par G-CSF est introduit à J23. L’état général, et respiratoire en particulier, du patient font récuser la réalisation d’une nouvelle endoscopie bronchique. L’amphotéricine B liposomale est stoppée à la sortie d’aplasie (J32). Le patient s’améliore lentement. Le scanner (J37) montre une fonte nécrotique du lobe inférieur gauche. Une nouvelle endoscopie bronchique (J39) trouve une obstruction complète de la bronche lobaire inférieure gauche par un bourgeon blanchâtre hémorragique. La présence de filaments mycéliens à l’examen direct de l’aspiration bronchique permet de poser le diagnostic de zygomycose, la culture poussera à Cb. L’amphotéricine B liposomale est ré-introduite (5mg/kg/j) et le patient bénéficie d’une lobectomie inférieure gauche. L’examen mycologique de la pièce opératoire confirmera le diagnostic de zygomycose invasive. L’étude de la sensibilité in vitro de cet isolat (EUCAST) montre des valeurs peu élevées pour l’amphotéricine B (0.25 mg/l) et le posaconazole (0.5 mg/l). Le posaconazole (200mgx3/j) est introduit à J47. La bithérapie antifongique est poursuivie pendant la durée de la chimiothérapie cytotoxique de consolidation. L’amphotéricine B liposomale est stoppée après 6 semaines de traitement et le posaconazole est poursuivi en monothérapie.

Les infections à Cb chez l’enfant sont rares. Six cas ont été rapportés dans la littérature, avec une majorité de garçons (4/6). Dans ce groupe, 5 patients sont atteints de leucémie aiguë et présentent une localisation pulmonaire. Les 3 enfants (50%) ayant survécu ont bénéficié d’une lobectomie et d’un traitement par amphotéricine B. Le posaconazole peut constituer un antifongique de choix dans le traitement de cette infection.

L’alcool favorise-t-il les zygomycoses ?

 Aude Lesenne¹, M. Thellier¹, Liliane Bodin², Charlotte Arbelot², A. Foucrier², G. Lecso¹, M. Palous¹, Sophie Brun¹ et Annick Datry¹

1. Service de Parasitologie-Mycologie, 2. Unité de Réanimation (Pr. JJ Rouby),  Hôpital Pitié-Salpêtrière 75013 Paris

 Mr C, 41 ans, a un accident de voiture le 19 juillet 2007 (alcoolémie = 2,50g / L). Il subit un choc violent contre un poteau EDF en béton et il est éjecté dans un fossé à 20 m de son véhicule. Il est adressé aux urgences du groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière.

A son arrivée, il présente un état de choc hémorragique avec défaillance multiviscérale, un polytraumatisme et une très large plaie du scalp. Une laparotomie et une suture du scalp sont réalisées. Le 22 juillet, le patient est fébrile (possible surinfection des sutures) et on instaure un traitement par imipénem-cilastatine vancomycine, ciprofloxacine et fluconazole. Le 27 juillet une hémoculture est positive à Candida albicans et le 1er août Mr C présente une pneumopathie à Pseudomonas aeruginosa traitée par aérosols de ceftazidime. Devant la persistance de la fièvre et l’absence d’amélioration de la plaie du scalp restant purulente, un nouveau prélèvement est réalisé le 9 août. Il met en évidence en bactériologie à P. aeruginosa et en mycologie 2 zygomycètes identifiés ultérieurement par le CNRM Pasteur comme étant Mucor circinelloides et Rhizopus microsporus. Le traitement comportera de la ceftazidime IV et du posaconazole (800 mg / j en 2 prises) en raison d’une insuffisance rénale ayant nécessité plusieurs dialyses péritonéales.

Le 20 août, Mr C présente une pneumopathie à P aeruginosa et à Enterobacter cloacae BLSE. Le 26 août un nouveau prélèvement de la plaie du scalp est positif en bactériologie (P aeruginosa multiR et à E. cloacae BLSE) et négatif en mycologie. L’ évolution sera bonne et le posaconazole est arrêté le 6 septembre après 26 jours de traitement. Mr C.sort en rééducation le 17 septermbre.

Les auteurs concluent et, selon les données de la littérature, à la nécessité d’associer chirurgie et traitement médical pour obtenir une évolution favorable des zygomycoses. Ces dernières étant résistantes au voriconazole et à la caspofungine, les traitements de référence sont à l’heure actuelle les amphotéricines et le posaconazole.

 Mucormycose cutanée à Saksenaea vasiformis : diagnostic mycologique

Catherine Kauffmann-Lacroix¹, D. Battandier ⁴, G. Le Moal ², E. Wierzbiecka ³, J. Dautremer ⁴, E. Dannaoui⁵

1-     Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale, 2- Service de Maladies Infectieuses et Tropicales, 3- Service de Dermatologie , CHU de Poitiers, 2 rue de la Milétrie  86021 Poitiers Cedex. c.lacroix@chu-poitiers.fr

2-     Service de Maladies Infectieuses et Tropicales Hôpital Necker -149, rue de Sèvres 75743 Paris Cedex 15

3-     5- CNRMA Institut Pasteur  25,28 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15

Histoire de la maladie

Mr C a consulté les infectiologues et les orthopédistes pour la 1^ère fois en 2006 pour prise en charge d’une ostéite malléolaire associée à une myosite de la jambe évoluant depuis 2002 et en échec d’un traitement par oxacilline. Dans ces antécédents on note un traumatisme de cette cheville (chute d’une grosse pierre sur le pied) responsable d’un hématome traité par drainage chirurgical. Une nouvelle antibiothérapie par vancomycine et rifadine a été débutée en novembre 2006 après prélèvements chirurgicaux profonds à visée bactériologiques (restés tous négatifs). Devant l’absence de succès clinique et biologique les antibiotiques ont été modifiés en janvier 2007 pour ceftazidime et ciprofloxacine dans l’hypothèse d’un bacille Gram négatif. Après une amélioration clinique passagère, le patient a été, à nouveau biopsié au niveau de l’os et du muscle en Mai 2007 du fait d’aggravation de l’ostéite (à nouveau négatifs). Puis en juin 2007 des biopsies cutanées du fait de lésions dermiques à bords granulomateux ont été pratiquées. Les conclusions anatomopathologiques orientent alors vers la présence de champignon filamenteux qui ont été confirmées lors d’une troisième biopsie chirurgicale en juillet 2007 (osseuse et cutanée) adressée en mycologie pour évaluer l’extension et confirmer cette zygomycose. Un traitement a été débuté avec l’amphotéricine B liposomale (Ambisome*) en perfusion mais très mal toléré. Devant le risque d’amputation, la prise en charge thérapeutique a été coordonnée à l’hôpital Necker et est encore en cours.

 Diagnostic mycologique

            Tous les milieux (Sabouraud avec et sans chloramphenicol) présentent une culture de champignon filamenteux grise, d’aspect typique de Mucorale. L’examen microscopique est pauvre, filaments siphonnés dont les sporanges semblent avoir disparu. La souche est adressée à l’Institut Pasteur où les cultures initiales sur milieux usuels n’ont pas permis la sporulation. Après culture du mycélium en milieu liquide et l’amplification PCR de la région ITS, la séquence obtenue est compatible avec un S. vasiformis. Un repiquage sur Czapeck  a permis d’obtenir les sporocystes caractéristiques au bout de 15 jours.

S. vasiformis a été isolé aux Indes et décrit par Saksenaea en 1953.  Ajello, en 1976 a décrit le premier cas humain. Grâce à une meilleure connaissance de ce zygomycetes, à ce jour une 30aine de cas, souvent cutanés, ont été rapportés. 

En  conclusion, la culture d’une mucorale sans obtention d’une sporulation doit faire suspecter un Saksenaea ou un Apophysomyces.

INFECTION INVASIVE A TRICHOSPORON INKIN CHEZ UN ENFANT REVELANT UN DEFICIT IMMUNITAIRE PRIMITIF

Nizar Mahlaoui¹, Marianne Debre¹, Bénédicte Neven¹, Stéphane Blanche¹, Alain Fischer¹, Catherine Doit² , Marie-Elisabeth Bougnoux³

 ¹Unité d’Immunologie et Hématologie Pédiatrique, ²Service de Microbiologie, Hôpital Robert-Debré, ³Service de Microbiologie, Hôpital Necker-Enfants Malades. Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Université Paris 5-René Descartes.

 Les infections invasives à Trichosporon inkin sont peu fréquentes et surviennent généralement sur des terrains prédisposants, en particulier des déficits immunitaires primitifs ou acquis. Nous rapportons ici le cas d’un enfant de 8 ans vivant à Paris et sans antécédents particuliers. Dans un contexte de toux fébrile et d’altération de l’état général, il a été découvert une infection du poumon droit, une infection de la région mastoïdienne et de la partie distale de la cuisse (abcès sous-cutané) avec atteinte osseuse fémorale). Trichosporon inkin a été isolé à partir de prélèvements obtenus stérilement : collection sous-cutanée au niveau de la mastoïde (culture pure), tissus issus du parage sous-cutané et au contact osseux fémoral. L’identification de l’espèce a été obtenue par séquençage de la région ITS1 de l’ADNr. L’étude in vitro de la sensibilité aux antifongiques a montré une CMI >32 µg/mL à la 5-fluorocytosine, 0.064 µg/mL au fluconazole,  0.006 µg/mL au voriconazole, 0.004 µg/mL au posaconazole, 0.5 µg/mL à l’amphotéricine B et >24-µg/mL à la caspofungine. Le bilan d’extension de ces lésions a retrouvé une atteinte osseuse costale (K1 à 3) et vertèbrale (L4, L5) sans aucune symptomatologie clinique. Orienté par la sévérité de l’infection, l’identification du microorganisme et par la notion de consanguinité familiale, il a été recherché (test de réduction du nitrobleu tétrazolium) et identifié une granulomatose septique chronique. Il s’agit d’un déficit immunitaire primitif de l’immunité innée d’origine génétique. La mutation chez cet enfant a été identifiée : délétion homozygote du gène NCF1 codant pour la sous-unité p47^phox du complexe NADPH oxydase. Sous bithérapie antifongique par Amphotéricine B liposomale et voriconazole per os l’évolution a été très rapidement favorable au niveau osseux et mastoïdien .La normalisation du syndrome inflammatoire biologique a été plus progressive. La réponse au niveau pulmonaire est partielle. Il reçoit actuellement des transfusions de globules blancs.

En conclusion, nous rapportons le cas d’un enfant de 8 ans présentant une infection disséminée à Trichosporon inkin avec atteinte osseuse multifocale, sous-cutanée et pulmonaire révélant un déficit immunitaire primitif. L’atteinte osseuse lors de cette infection n’a, à notre connaissance, pas été rapportée dans la littérature.

 Infection articulaire à Scedosporum apiospermum (SA) chez un patient ayant une polyarthrite rhumatoïde traitée par rituximab.

 A.Balageas^a, R Brault^a, E Solau-Gervais^a, C.kauffmann-Lacroix^b, M. Puyade^a, F.Debiais^a.

^a Service de Rhumatologie, ^b Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale,

C.H.Ude Poitiers, 2 rue de  la Milétrie, 86021 Poitiers Cedex, France.

r.brault@chu-poitiers.fr

 Les infections ostéo-articulaires fongiques sont rares et peuvent être aussi dangereuses que torpides. Nous rapportons un cas d’arthrite du coude à Scedosporum apiospermum chez un patient immunodéprimé, souffrant d’une polyarthrite rhumatoïde (PR) et traité par rituximab, anticorps anti-CD20.

Un homme, âgé de 73 ans, est suivi dans le service pour une PR destructrice évoluant depuis 40 ans rebelle aux traitements antérieurs. Le coude gauche a été le siège d’une synovite chronique persistante malgré 6 infiltrations et synoviorthèses: en 2002 (diprostène), 2003 et 2006 (hexatrione), 2004 et en mars 2006 (Rhénium). Les deux premières injections de rituximab réalisées le 4 et 20 mars 2007, ont été parfaitement tolérées. Le 31 mars 2007, il a présenté une arthrite du coude gauche avec écoulement spontané. Le bilan biologique a retrouvé une CRP <1mg/l et une VS à 7 mm. Les radiographies et l’IRM  confirment l’ostéoarthrite avec d’importantes images destructrices. Le prélèvement identifie un champignon filamenteux: Scedosporum apiospermum (SA). Les prélèvements systémiques ont été négatifs. Le traitement initial par kétoconazole a été pris pendant 15 jours puis remplacé par voriconazole  400mg/jour poursuivi pendant 12 semaines et bien toléré. Un arthrolavage avec synovectomie a été également effectué. L’évolution clinique a été favorable.

 SA est un champignon ubiquitaire surtout présent dans le sol et les eaux stagnantes. Il est plus fréquemment pathogène chez l’immunodéprimé chez qui il est souvent à l’origine de formes disséminées. Dans la littérature, 15 cas d’arthrites à SA sont rapportées. Il s’agissait de 13 hommes et de 2 femmes. L’âge moyen des patients était de 33.33 ans avec des extrêmes allant de 5 à 65 ans. Douze patients étaient immunocompétents. Le genou était l’articulation la plus fréquemment atteinte. Le mode de contamination était le plus souvent une inoculation directe intra-articulaire du germe survenant après un traumatisme ou une infiltration intra-articulaire. Le délai entre la contamination et l’apparition des symptômes variait entre  4 jours  et 14 mois. Les signes systémiques étaient absents dans la majorité des cas. Le diagnostic a reposé sur l’examen direct du produit pathologique et la culture sur milieu de Sabouraud. L’évolution sous traitement  adapté (médical et parfois chirurgical) a été  le plus souvent favorable. Une infection disséminée a été constatée et le patient est décédé.

 Les mycoses ostéoarticulaires doivent être systématiquement recherchées devant toute manifestation d’allure infectieuse dont les prélèvements sont négatifs ou révèlent une bactérie qui à l’évidence n’est pas l’agent causal. Dans les infections articulaires à SA, l’association du traitement médical et chirurgical donne de bons résultats. Le risque de survenue de complications tardives nécessite cependant un suivi à long terme.

Infection pulmonaire invasive à Trichoderma longibrachiatum survenue chez un patient neutropénique et traitée avec succès par voriconazole et caspofongine.

 A. Alanio,¹ B. Brethon,² Martine Feuilhade de Chauvin,¹ E. de Kerviler,³ T. Leblanc,² Claire Lacroix,¹ A. Baruchel² et J. Menotti¹

 ¹Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, ²service d’Hématologie Pédiatrique et ³service de Radiologie, hôpital Saint-Louis, AP-HP, Paris, France

Un garçon de 16 ans hospitalisé pour chimiothérapie d’induction d’une leucémie aiguë lymphoblastique B, inclus dans le protocole FRALLE 2000-BT, a développé après une période de neutropénie prolongée de 24 jours une chondrite de la narine droite. Une polychimiothérapie anti-infectieuse à large spectre, incluant la caspofungine, a été débutée. Dix jours plus tard, le patient est devenu fébrile sans point d’appel infectieux. Un scanner pulmonaire a révélé des lésions parenchymateuses nodulaires disséminées, évoquant fortement une aspergillose pulmonaire invasive. Malgré des antigénémies aspergillaires (Platelia Aspergillus, Bio-Rad) toujours négatives, le diagnostic d’aspergillose pulmonaire invasive a d’abord été retenu. Les prélèvements pulmonaires effectués ont montré la présence de filaments mycéliens à l’examen direct ; l’examen macroscopique et microscopique des cultures a mis en évidence un Trichoderma sp. dans l’expectoration, l’aspiration bronchique et le lavage broncho-alvéolaire. Le séquençage d’une portion du gène de l’ARN ribosomique du champignon a permis l’identification de Trichoderma longibrachiatum.

Le patient a été traité par 2 semaines de bithérapie par voriconazole et caspofungine, puis par 6 semaines de voriconazole seul, avec une bonne efficacité et une bonne tolérance. Les nodules pulmonaires ont totalement régressé à la fin du traitement. Après une couverture antifongique en prophylaxie secondaire à chaque cure de chimiothérapie, le patient a été considéré comme définitivement guéri de son infection fongique 10 mois après le diagnostic.

Dans la littérature, seuls 4 patients immunodéprimés infectés par T. longibrachiatum ont jusqu’à présent été traités avec succès. Nous rapportons ici le premier cas traité par une association voriconazole-caspofungine. Ce succès, obtenu dans une affection de pronostic grave, devra être confirmé par d’autres équipes.

 A propos d’un cas d’infection  pulmonaire à  Hormographiella aspergillata (Coprinus cinereus) chez une patiente atteinte de leucémie aigue biphénotypique

E. Randriamalala ¹, D. Garcia-Hermoso ⁴, C. Godet ², F. Guilhot ¹, MH Rodier ³, C. Kauffmann- Lacroix ³   1. Service d’Onco-Hématologie , 2. Service de Maladies Infectieuses et Tropicales, 3. Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale CHU de Poitiers, 2 rue de la Milétrie  86021 Poitiers cedex, France e.randriamalala@chu-poitiers.fr   4. CNRMA Institut Pasteur  25,28 rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15

Il s’agit d’une jeune femme de 23 ans, sans antécédents particuliers, appartenant à une Communauté des gens du voyage semi sédentaire, atteinte d’une leucémie aiguë biphénotypique diagnostiquée le 6 Avril 2007 lors de l’exploration d’une asthénie et gonalgie gauche avec épanchement modéré.

L’hémopathie s’est présentée sous une forme hyperleucocytaire modérément tumorale (adénopathies superficielles splénomégalie) et anomalies cytogénétiques clonales t(3 ;4), der(11) der (12) sans remaniement du gènes MLL en biologie moléculaire. Courte pré-phase corticoïde sur 4 jours  (sensibilité) puis  à partir du  18/04/2007 chimiothérapie d’induction de rémission par Idarubicine 3x 12 mg/m² et Aracytine 5 x1 g/m²/12h. Aplasie non blastique à J15 et rémission complète cytogénétique ont été obtenues le 04/06/07. Ce traitement s’est compliqué d’une cytolyse hépatique à 10N post cortisonique d’évolution favorable puis d’une aplasie fébrile nécessitant cefotaxime gentamycine puis vancomycine et l’introduction empirique de caspofungine. Le 09/05/07 (J23), alors que la patiente est encore en aplasie, survenue d’une pneumopathie lobaire supérieure droite distale accompagnée d’une toux sèche et d’une douleur dorsale para scapulaire droite. Le scanner thoracique a montré un foyer hyper dense aux contours mal limités, plus ou moins spiculés, dans la partie postéro basale du lobe supérieur droit et touchant la plèvre. Pas de documentation microbiologique à la fibroscopie et LBA, et du sérum du  12/05/2007 (J26). L’aspect tomodensitométrique faisant penser à une aspergillose changement de la caspofungine pour voriconazole. Persistance de la fièvre et aspect progressif des images au scanner de contrôle du 22/05/2007, possiblement liée à la sortie d’aplasie. La ponction-biopsie de la lésion pulmonaire sous scanner le 25/05/2007 a montré de rares filaments mycéliens. L'identification de Hormographiella aspergillata (Basidiomycète, ordre des Agaricales) a été réalisée par méthodes phénotypiques et confirmation par amplification et séquençage des régions ITS.

Remplacement du voriconazole par Ambisome 5 mg/kg/j mais a

bsence d’indication opératoire vue l’étendue de la lésion jusqu’à la paroi avec érosion costale. Parallèlement il y avait un ascite de type exsudatif dont l’étude microbiologique est négative. Possibles localisations hépatospléniques non prouvées par  la biopsie hépatique trans jugulaire. L’évolution clinique a été favorable et concomitant de la sortie d’aplasie avec apyrexie, disparition de la douleur dorsale et tarissement de l’ascite. Evolution de la lésion pulmonaire vers l’excavation dont la taille  a diminué sur les contrôles tomodensitométriques successifs (4 cm de diamètre le 22/8/07). Espacement de l’Ambisome à 3 injections par semaines après trois mois de traitement en raison d’un début de toxicité rénale. Impossibilité d’une consolidation intensive et donc chimiothérapie d’entretien par Purinethol VP16 puis blocs d’ Aracytine  alterné au Methotrexate.

Décision d’allogreffe de cellules souches périphériques à partir de sa sœur jumelle après un conditionnement myéloablatif par Irradiation corporelle totale 12 gray et Endoxan 120 mg/kg. La patiente est actuellement au 13 ème jour de la greffe. Passage de l’Ambisome tous les jours à 5 mg/kg  depuis  l’aplasie précédant la reconstitution hématopoïétique et pendant au moins 3 mois encore.

La revue de la littérature est pauvre avec seulement 6 cas dans la dernière décade, dont l ‘évolution a été le plus souvent défavorable.

 INFECTION DERMIQUE A CLADOPHIALOPHORA CARRIONII CHEZ UN PATIENT TRANSPLANTE RENAL ET PANCREATIQUE.

Charlotte Dupont¹, TA. Duong², S. Mallet ³, MF. Mamzer⁴, Eric Thervet⁴, ME. Bougnoux¹, B. Dupont⁵

Laboratoires de Parasitologie-Mycologie¹ et d’Anatomopathologie², Services de Dermatologie³, Transplantation Rénale⁴ et de Maladies Infectieuses et Tropicales⁵. Hôpital Necker-Enfants Malades. Paris.

Les infections dermiques dues à des champignons noirs, ou dématiés, sont des complications infectieuses rares chez les patients transplantés, bien que le nombre de cas rapportés ait  considérablement augmenté ces dernières années, notamment après transplantation rénale. Le genre Alternaria est le plus fréquemment isolé chez ces patients. Les dématiés, qui  regroupent plus de 70 genres et 130 espèces, sont responsables d’infections dermiques dont les expressions cliniques et histologiques sont variées. Nous rapportons ici un cas particulier d’infection dermique à dématiés chez un patient transplanté d’organes solides.

Un homme de 58 ans transplanté rénal et pancréatique en 2000 pour un diabète insulinodépendant est vu en consultation de dermatologie en février 2007 pour des nodules cutanés au niveau du coude droit. Ce patient d’origine tunisienne vit en France et effectue 2 voyages annuels en Tunisie. A l’examen clinique, trois nodules fermes, croûteux, douloureux et un nodule sous cutané d’apparition plus récente sont observés. L’examen histologique de la biopsie d’un des nodules cutanés met en évidence de nombreux filaments mycéliens. L’examen direct des appositions de la biopsie montre des éléments fongiques à paroi épaisse et des filaments mycéliens de taille et d’aspect variés dont la paroi est noire. Le diagnostic est orienté vers une phaeohyphomycose. La culture sur milieu de Sabouraud permet d’isoler en 3 jours des colonies de couleur vert foncé dont l’examen microscopique ne décèle que des filaments mycéliens. L’identification de Cladophialophora carrionii est obtenue par séquençage de la région ITS1 de l’ADN ribosomal à partir d’une colonie. Ce champignon est un agent étiologique de la chromoblastomycose, mycose exotique. La relecture des lames d’anatomopathologie a permis d’observer la présence de cellules fumagoïdes qui sont caractéristiques de la chromoblastomycose, confirmant le diagnostic. Le patient qui a été perdu de vue pendant six mois a été traité en septembre 2007 par posaconazole (800 mg/j en 2 prises) tout en maintenant un traitement immunosuppresseur par adaptation des doses de tacrolimus.

Ce cas souligne l’importance de la confrontation anatomopathologique et mycologique dans la démarche diagnostique et permet de discuter des traitements antifongiques de la chromoblastomycose chez les patients immunodéprimés.

 AUDIT CLINIQUE DES PRESCRIPTIONS D’ANTIFONGIQUES SYSTEMIQUES AU CHU DE BESANCON

Sophie RAYMOND¹, T. HENON^1,5, F. GRENOUILLET^2,5, M.-C. WORONOFF-LEMSI^1,4, S. LIMAT^1,4, J. LEROY^3,5

Pharmacie¹, Mycologie², Maladies Infectieuses³, INSERM U645⁴ & Commission des Anti-Infectieux⁵, CHU Minjoz, 25030 BESANCON                        fgrenouillet@chu-besancon.fr

 Depuis la mise en place d’une politique d’amélioration continue de la qualité des soins, l’évaluation des pratiques professionnelles est devenue indispensable dans les établissements de santé. Le principe d’un audit clinique est de comparer ce qui est fait à ce qui devrait être fait (défini par un référentiel). Des recommandations de prescriptions des antifongiques sont en place au CHU de Besançon depuis 2003, et ont été réactualisées en 2005.

L’objectif principal de ce travail est d’évaluer l’application de ce référentiel, via un audit clinique des prescriptions d’amphotéricine B liposomale, de voriconazole et de caspofungine, les trois antifongiques concernés par la liste T2A. L’objectif secondaire est d’évaluer la conformité de l’indication sélectionnée lors de la commande à la pharmacie. Celle-ci est devenue indispensable depuis la signature des contrats de bon usage entre le CHU et l’Agence Régionale d’Hospitalisation (ARH), définissant le financement spécifique de ces molécules onéreuses par l’assurance-maladie.

Les critères d’évaluation  de cet audit clinique ont été : la pertinence de l’indication, l’absence d’alternative meilleure, le respect de la posologie et de l’éventuelle dose de charge, le timing (adaptation du traitement, en fonction de l’évolution clinique et des données biologiques). Cette étude rétrospective préliminaire porte sur un panel représentatif des prescriptions de l’ensemble des services, de janvier à juin 2007.

63 prescriptions d’antifongiques T2A ont été analysées sur les 154 recensées, correspondant à 47 patients (38 d’onco-hématologie), et 51 séjours hospitaliers. Le taux de conformité globale atteint 51%. L’indication d’un antifongique était justifiée pour 60 prescriptions (95%). Dans 30% des cas, une alternative meilleure, c’est-à-dire plus efficace, moins onéreuse ou moins toxique était recommandée. La posologie et la dose de charge étaient conformes dans respectivement 84% et 76% des cas. Concernant l’indication nécessaire à la commande informatique de l’antifongique, son taux de conformité est de 29%.

Cette étude nous a permis de mieux cerner les pratiques d’utilisation des antifongiques systémiques dans notre établissement. Elle a mis en évidence notamment une « sur-prescription » de la caspofungine à la place de l’amphotéricine B desoxycholate, en première intention dans la neutropénie fébrile et les candidoses systémiques, en l’absence d’insuffisance rénale ou de médicaments néphrotoxiques. Cette étude souligne la nécessité de mettre à jour régulièrement les référentiels, pas toujours en phase avec l’évolution des pratiques. De nouvelles recommandations internationales, en cours de publication, devraient inspirer la future version de notre référentiel local. Le fort taux de non-conformité de l’indication communiquée à la pharmacie semble associé à un manque d’information des soignants, or ce paramètre est critique dans le cadre du contrat de bon usage ARH-CHU. A terme, cet audit préliminaire devrait être élargi à un plus large échantillon de patients afin d’augmenter la puissance de nos résultats.

CANDIDA INCONSPICUA DANS UN SERVICE D’HEMATOLOGIE CLINIQUE :

ETUDE DE CAS GROUPES

BREBION Amélie ¹, JANEL Alexandre ¹, CACHEUX Victoria ², MOUGEOT Geneviève ¹, PONS Denis ¹, CAMBON Monique ¹

 ¹ Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU de Clermont-Ferrand; ² Service d’Hématologie clinique, CHU de Clermont-Ferrand

 Jusqu’en janvier 2007, C. inconspicua, considéré comme une levure émergente, était une espèce rarement mise en évidence (1 à 2 fois par mois) au Laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU de Clermont-Ferrand. Entre février et mai 2007, une forte augmentation du nombre de prélèvements positifs en culture à C. inconspicua a été constatée. Ces prélèvements, essentiellement des selles, provenaient pour la plupart de patients hospitalisés dans le service d’Hématologie Clinique (Pr J.O. Bay).

En mars 2007, 12 patients hospitalisés en Hématologie clinique avaient au moins un prélèvement positif en culture à C. inconspicua. Les patients en aplasie bénéficiaient de manière hebdomadaire d’un examen mycologique des selles et d’un traitement prophylactique par fluconazole en cas de mucite ou candidurie.Le service d’Hématologie clinique est resté vigilant face à cette forte proportion de patients porteurs mais devant le faible nombre de cas décrits dans la littérature, dans lesquels   C. inconspicua est incriminé dans de réelles infections, il n’a pas changé ses habitudes de prescription (mycologie des selles hebdomadaire, prophylaxie par fluconazole).

               En mai, deux patients atteints de LAM présentaient des hémocultures positives à        
  C. inconspicua, lors de l’aplasie post-chimiothérapie d’induction. Il s’agissait d’un 
as probable de colonisation de cathéter veineux central et d’une réelle fongémie.

Un antifongigramme (méthode E-Test) a été réalisé pour les isolats de dix patients du service d’Hématologie clinique. Les dix souches testées étaient sensibles in-vitro à l’amphotéricine B (CMI la plus élevée : 0,06µg/ml) et au voriconazole (CMI la plus élevée : 0,25µg/ml) mais de sensibilité diminuée au fluconazole : 6 souches étaient de sensibilité dose-dépendante (CMI 16 à 32 µg/ml) et 4 étaient résistantes (CMI > 64 µg/ml).

   La nette diminution des cas de portage à partir de juin a coïncidé avec la réalisation d’aménagements
 en mai au sein du service d’Hématologie clinique. En effet, au cours du mois de mai 2007, le secteur 
conventionnel du service a été progressivement fermé pour permettre la réalisation d’aménagements 
et de travaux de rénovation. Il a été rouvert le 6 juin 2007, composé de 5 lits à flux mobile et 
13 lits d’hospitalisation conventionnelle. Le secteur protégé (7 lits) est resté ouvert durant les travaux.

               Plusieurs questions épidémiologiques restent à approfondir : est-ce bien
 un portage acquis lors de l’hospitalisation ? Quel est le mode de transmission de 
C. inconspicua (aucun prélèvement d’environnement ni du personnel hospitalier n’a été effectué par
 le service d’Hygiène Hospitalière) ? De plus, l’étude phylogénétique des différents isolats n’ayant 
 pu être réalisée pour des raisons techniques, cet épisode n’a pas pu être classé comme épidémie. 
Une étude ultérieure est envisagée.

               Entre juin et septembre 2007, un maximum de deux nouveaux patients porteurs de 
C. inconspicua dans les selles a été dépisté mensuellement. En octobre, C. inconspicua a été
 mis en évidence dans les selles de cinq nouveaux patients. Il est donc nécessaire de rester vigilant.

  Apport de la biologie moléculaire dans le diagnostic

de balle fongique sinusienne de l’immunodéprimé.

 ABERMIL Nasséra¹, TOUSSAINT G.², BOTTEREL F.¹, FOULET F.¹, COSTE A.², PAPON JF.², BRETAGNE S.¹

 ¹Service de Parasitologie-Mycologie, APHP, CHU Henri Mondor, 94000 Créteil ;

²Service d’ORL Centre Hospitalier Intercommunal de Créteil, 94000 Créteil. Les balles fongiques sinusiennes sont des conglomérats de filaments mycéliens qui se développent de manière non invasive dans les cavités sinusiennes. Chez l’immunodéprimé, cette atteinte est rare et se localise essentiellement au niveau des sinus sphénoïdaux et ethmoïdaux. Le traitement des balles fongiques chez ces patients est essentiellement chirurgical, mais un traitement médical peut y être associé d’où la nécessité d’une identification de l’espèce fongique responsable. Cette identification est souvent difficile car seules 30% à 50% des cultures sont positives.

But de l’étude Les objectifs de cette étude étaient (1) de valider une technique automatique d’extraction d’ADN à partir de tissus inclus en paraffine, (2) de déterminer par PCR en temps réel les espèces fongiques responsables de ces balles fongiques.

Matériels et méthodes Une étude rétrospective a été menée par le service d’ORL du Centre Hospitalier Intercommunal de Créteil et du CHU Henri Mondor. Parmi 181 patients opérés de balles fongiques entre 1997 et 2007, 19 , étaient immunodéprimés (causes ? éventuellement). De ces 19 patients, les coupes de balles fongiques incluses en paraffine ont été obtenues pour16 patients.

Les ADN ont été extraits de 5 coupes de 10µm par échantillon à l’aide du Kit EZ1 DNA tissue^® (Qiagen, France) et du BioRobot^® EZ1 (Qiagen, France). Les quantités obtenues ont été dosées par UV à l’aide d’un NanoDrop^® (NYXOR Biotech). Une PCR temps réel ciblée sur un gène mitochondrial d’Aspergillus fumigatus/flavus a été effectuée sur tous les extraits d’ADN. Le test a été réalisé en duplicate sur l’automate LightCycler 1.5^® (Roche). en utilisant le Kit LC Fast start DNA Master Hybridation Probes^®. Tous les extraits d’ADN ont également été soumis à une amplification « pan fongique » ciblée sur l’ARNr 18S pour s’assurer de la présence d’ADN fongique amplifiable.

Résultats. Les concentrations d’ADN extraits étaient différentes d’un échantillon à l’autre, de 1ng/µL à 10ng/µL. La PCR Aspergillus était positive pour 15 des 16 échantillons et la PCR pan fongique était positive pour tous les échantillons.

Discussion - Conclusion La technique d’extraction à partir de coupes de paraffine par le robot BioRobot^® EZ1 a donné des ADN de qualité suffisante pour les amplifications réalisées. Cependant, la quantité d’ADN obtenue à partir des coupes anatomopathologiques est variable et dépend de la qualité du prélèvement anatomopathologique. Les résultats de la PCR pan fongique concordent avec l’analyse anatomopathologique des tissus, qui montre la présence de filaments mycéliens dans tous les échantillons. Sur cette petite série, 94% des balles fongiques contiennent au moins un champignon du genre Aspergillus. Ceci confirme la difficulté a obtenir des cultures positives à partir des balles fongiques car seules 30% des échantillons étaient culture positive. L’analyse d’autres séquences sont nécessaires pour une identification précise des échantillons ne contenant pas d’Aspergillus

Transcription profiling of Candida albicans genes in a CaRAS1 mutant treated with cAMP.

Maria Novella Vespa,* Andrè Nantel,**Malcolm Whiteway **

 The gene RAS1 encodes a signal transduction GTPase that is proposed to regulate the cAMP and MAP kinase pathways in the fungal pathogen C. albicans.  Ras1p functions in hyphal induction and virulence in C. albicans. We studied the action of cAMP on CaRAS1mutant cells grown in liquid Lee’s medium at either 30C or 37C for 5h. We compared control cultures with cultures supplemented with cAMP to a final concentration of 10mM at each temperature. Total RNA was extracted and used for microarray analysis. GeneSpring software (Agilent Technologies) was used for normalization and for the identification of significantly regulated transcripts. For analysis of the transcriptional response under each experimental condition, five individual biological replicates were used. After 5h cells were observed microscopically at 30C and 37C to monitor morphological changes. In Lee’s medium  at 37C there were minor morphological differences between the control culture and culture with cAMP; both cultures showed germ tubes and hyphae, although the cultures with cAMP showed more extensive filamentation than the control. At 30C the control cultures showed primarily yeast cells with a few germ tubes, but the cultures with cAMP exhibited hyphae and pseudohyphae although less than the cultures at 37C. Thus at 37C, cells of CaRAS1 mutant, grown in Lee’s medium, have the ability to undergo the yeast-to hyphal transition without cAMP addition. These results suggest that RAS1 is not essential for the activation of the transcriptional program for the yeast-to hyphal transition at 37C in Lee’s medium, and thus other gene(s) can apparently replace the function. In contrast, at 30C in Lee’s medium, cells of the CaRAS1 mutant exhibited the yeast-to hyphal transition only in the presence of cAMP. Transcriptional analysis of the cAMP response at both 30C and 37C showed strong induction of the peroxisomal matrix genes orf19.7520, orf19.1288, orf19.1652, orf19.4591, orf19.2896,  orf19.1704 and orf19.3684.

 *  Istituto Superiore di Sanita  Roma  Italy  A.I.D.S. programme

**National Research Council  Montreal QC  Canada

Corresponding authors.E-mail: malcolm.whiteway@cnrc-nrc.gc.ca

           Ce  travail  de  recherche est  dédié  à Monsieur le Prof. Bernard Bizzini, avec toute ma  reconnaissance.

 INFECTIONS FONGIQUES MULTIPLES CHEZ UN PATIENT NEUTROPENIQUE : ASPECTS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES

 L. EPELBOIN ¹, P. AGNAMEY ², N. DAHAME ², C. SALANOUBAT ³, O. LEGRAND ³, A. RABBAT ¹, M. CORNET ².

 Services de Réanimation Médicale ¹, Microbiologie ² et Hématologie Clinique ³, Hôtel-Dieu, AP-HP, Paris.

 Nous rapportons le cas d’un patient âgé de 68 ans, insuffisant rénal chronique, présentant une transformation aiguë d’un syndrome myélodysplasique évoluant depuis deux ans. Au décours de la chimiothérapie d’induction par daunorubicine et aracytine, alors qu’il est en aplasie profonde (leucocytes < 100.10⁶/L) depuis 14 jours, il développe successivement sur une période de 3 semaines :

• une candidémie à Candida kefyr traitée par échinocandine : le patient est inclus dans l’essai clinique 03-0-192 qui évalue la Micafungine versus la Caspofungine dans le traitement des candidoses invasives.
• une fusariose disséminée à Fusarium dimerum diagnostiquée grâce à la biopsie cutanée. Cette fusariose survient après 16 jours de traitement par une échinocandine qui est alors remplacée par le Vfend^®.
• une aspergillose pulmonaire invasive à Aspergillus fumigatus contemporaine de la fusariose et traitée également par Vfend^®.
• une pneumocystose pulmonaire à Pneumocystis jiroveci.

Le patient décède rapidement après le diagnostic de pneumocystose dans un tableau de défaillance multiviscérale.

Sur le plan diagnostique, cette observation confirme l’importance de la biopsie cutanée chez un patient à risque d’infection fongique invasive. En effet, chez ce patient,  les lésions cutanées liées à la fusariose sont apparues au décours d’une première infection fongique déjà documentée.

Sur le plan thérapeutique, cette observation alimente le débat sur l’éventuelle sélection d’espèces résistantes (Fusarium sp.)  par l’utilisation d’antifongiques à spectre limité (échinocandines). De plus, les traitements successifs par échinocandine et Vfend® n’ont pas permis d’empêcher le développement et la progression de l’aspergillose chez ce patient resté profondément neutropénique pendant plus de 40 jours.

Microsporum amazonicum à l’origine d’une dermatose du visage

Nelly Contet-Audonneau*, Marie Machouart*, Michel Miegeville**, Aurélie Jager ***et Sybren de Hoog*****

 Laboratoire de Parasitologie-Mycologie CHU de Nancy*, Laboratoire de Parasitologie-Mycologie CHU de Nantes**, Laboratoire Jager à Boulay***, CBS Utrecht, Pays-Bas****

L’enfant Estelle, 9 ans est vue par son médecin en Août 2007 pour une lésion érythémateuse du visage localisée dans la région sous-narinaire. Le diagnostic de mycose est porté et le médecin adresse l’enfant au laboratoire pour un prélèvement mycologique. Il prescrit de la ciclopiroxolamine en crème.

            L’interrogatoire permet de préciser l’origine géographique de l’enfant, Estelle habite à Kourou en Guyane, elle est en Lorraine de façon temporaire. Il n’y a pas de notion de contact avec des animaux.

            La culture nous est transmise pour identification.

Les colonies sont duveteuses, blanc-grisâtres, elles poussent en cercles concentriques sur le repiquage réalisé sur milieu de Sabouraud. Aucun pigment n’est observé au verso.

Des microconidies piriformes trapues sont présentes, associées à de très nombreuses macroconidies, très finement rugueuses, présentant 3 à 4 logettes et mesurant 13-35 µm sur une largeur de 6-9 µm.

Les macroconidies gardent à leur base, après libération, un fragment de cellule résiduelle.

Cette souche est uréase positive en 8 jours et ne fait pas virer le milieu BCP caséine.

            Ces différents caractères correspondent à Microsporum amazonicum. Il s’agit d’un dermatophyte tellurique qui a été décrit en 1967 par Moraes à partir de prélèvements chez des rats, apparemment sains, au Brésil. La forme parfaite est Nannizzia borellii, actuellement Arthroderma borellii (1975).

            Microsporum amazonicum, dermatophyte tellurique et zoophile d’Amérique du Sud  peut donc aussi être un parasite de l’homme, comme le démontre ce cas clinique.

     1,3-β-D-GLUCANE ET INFECTIONS FONGIQUES INVASIVES.

 Renée GRILLOT

 Unité de Parasitologie-Mycologie, Département des Agents Infectieux, CHU de Grenoble

RGrillot@chu-grenoble.fr

 Les difficultés diagnostiques des infections fongiques invasives (IFI) ont largement favorisé le développement de tests permettant de rechercher dans le sang circulant des molécules relarguées par le champignon au cours de l’infection, marqueurs présumés du processus invasif. C’est ainsi que la détection et le dosage de composants polysaccharidiques  pariétaux, spécifiques de certains genres ou espèces fongiques, tels les mannanes de Candida albicans ou le galactomannane d’Aspergillus, sont devenus des outils précieux utilisés de façon routinière en mycologie clinique.

 Parmi ces molécules, le 1,3-β-D-glucan (BG) présente la particularité : 1) d’être un composant pariétal majeur partagé par de nombreuses espèces de champignons d’intérêt médical dont Pneumocystis jirovecii (mais Cryptococcus spp et les zygomycètes font exception), 2) d’être présent a l’état normal dans le plasma humain à des taux extrêmement faibles, 3) et enfin de voir l’élévation de sa concentration plasmatique corrélée avec la survenue de mycoses systémiques prouvées et d’origine variée. Néanmoins, si ces notions sont connues depuis plus de vingt ans (travaux d’OBAYACHI, Japon), la détection du BG n’à réellement émergé dans l’arsenal biologique comme marqueur potentiel des IFI que depuis très peu de temps : situation qui résulte d’un ensemble de causes à la fois techniques et stratégiques.

 D’un point de vue technique, plusieurs tests de détection quantitative du BG utilisant le principe du « Limulus Test » ont été développés au cours de ces deux dernières décennies par divers fabricants, au Japon puis aux USA, sous des appellations différentes et avec des systèmes biochimiques variés : d’où des résultats hétérogènes et une relative confusion pour en déduire l’intérêt diagnostique et les valeurs pronostiques positive et négative de ce marqueur dans les IFI.

 En pratique, Fungitell (Associates of Cap Code, USA) agréé par la FDA en 2004 est le test actuellement disponible commercialement en Europe (marquage CE en cours) : il utilise le principe de la reconnaissance du BG par le système d’immunité innée d’un petit crustacé, Limulus polyphemus. L’activation spécifique du facteur G du lysat d’amoebocytes du Limulus (LAL) entraine la cascade d’enzymes intervenant dans la coagulation du LAL, activation détectée par le clivage d’un substrat chromogène synthétique. La sensibilité analytique du test est très élevée puisque Fungitell permet de détecter des quantités de BG de l’ordre du picogramme/mL : pour le sérum la valeur du cutoff a été fixée à 20 pg/mL. Par ailleurs, tout risque d’interférence avec le LPS a été supprimé. Les valeurs retenues pour l’interprétation du BG sont les suivantes : < 60 pg/mL : négatif, ≥ 80 pg/mL : positif.

             Du point de vue de l’évaluation de la détection du BG, si l’on ne retient dans la littérature que les études réalisées avec Fungitell, les travaux publiés se résument à quatre études :

- une étude multicentrique cas-témoin (OSTROSKY-ZEICHNER et al, CID 2005, 41 : 654-9), conduite chez 170 sujets témoins négatifs et 163 patients ayant une IFI prouvée ou probable. Le but était de définir l’intérêt du BG pour le diagnostic des IFI. Les auteurs rapportent une sensibilité et une spécificité  de 64,4% et 92,4%, avec une VPP de 89% et une VPN de 73% quand le seuil de positivité choisi est de 80 pg/mL. Bien que les résultats semblent montrer un intérêt réel du test, certains points méthodologiques sont critiquables et les caractéristiques réelles du test (spécificité, VPP) sont certainement inférieures à celles rapportées (UPTON et al, CID 2006, 42 : 1055-6, PONTON J et al, CID 2006, 43 : 263-4).

- Une étude rétrospective sur 156 patients dont 78 atteints d’infections fongiques ou bactériennes (PICKERING JW et al, JCM 2005, 43 : 5957-62). Sensibilité, spécificité, VPP et VPN sont respectivement de 93,3%, 77,2%, 52% et 97,8%. Sont notamment soulignées les causes nombreuses de réactions faussement positives du BG, d’origine médicamenteuses ou non, ainsi que de faux négatifs liés à des taux sériques élevés en bilirubine et triglycérides.

- Une étude prospective (PAZOS et al, Rev Iberoam Micol, 2006, 23 : 209-15) limitée au suivi de 35 épisodes de neutropénies chez des sujets adultes et combinant deux tests : BG et dosage d’Ac anti-germe tube de C. albicans, combinaison qui fournit une VPP de 100%. Concernant le BG, sensibilité, spécificité, VPP et VPN sont de 83,3%, 86,2%, 55,5% et 96,1%, avec 10,3% de réactions faussement positives. Point d’intérêt souligné par les auteurs : le fait qu’une colonisation candidosique même lourde ne semble pas fausser positivement le test. 

- Une étude chez une cohorte de120 enfants hospitalisés non immunodéprimés et non infectés (SMITH PB et al, Clin Vaccine Immunol 2007, 14 :924-5), visant à déterminer les taux moyens de BG présents chez l’enfant. Le but était de poser les bases indispensables à des études cliniques ultérieures. La moyenne des taux de BG chez l’enfant s’est révélée nettement supérieure à celle rapportée chez l’adulte sain : 68 pg/mL versus 48 pg/mL.

- Enfin, aucune étude ne semble avoir été réalisée à ce jour pour définir la place de Fungitell dans le diagnostic des pneumopathies à Pneumocystis jirovecii, malgré l’intérêt potentiel évident du BG souligné par l’étude de TASAKA S et al, (Chest 2007, 131 : 1173-80), mais réalisée avec un réactif commercial sensiblement différent.

 L’EORTC/MSG a récemment décidé d’inclure la détection du 1,3-β-D-glucane dans les critères diagnostiques des IFI, à côté de celle du galactomannane aspergillaire (GM) (version révisée en cours de préparation), la PCR en temps réel étant elle, considérée comme encore à l’étude. GM et BG ont bien sûr, chacun leurs avantages et leurs inconvénients (SEGAL BH et al, CID 2007, 44 : 402-9) : mais si les variables qui affectent la valeur du GM sont maintenant bien cernées, l’expérience avec le BG est encore très limitée, et son utilisation dans les différents types de mycoses invasives et dans les différentes populations de patients à haut risque dont les receveurs de CSH, nécessitent des études complémentaires.

 On peut néanmoins considérer que : - la VPN très élevée du BG, - sa sensibilité clinique a priori supérieure à celle du GM, - et les causes de fausses positivités très différentes de celles observées avec Platelia-Aspergillus, feront que la combinaison de ces deux marqueurs compense leurs défauts respectifs et permette une interprétation plus aisée des tests diagnostiques des IFI. Et on attend plus que jamais que des études cliniques prospectives, avec contrôles appariés et associant tous les marqueurs diagnostiques des IFI aujourd’hui disponibles, soient engagées ...

 

CINETIQUE sérique deS  (1,3)-ß-D-Glucanes AU COURS DE LA pneumonie à Pneumocystis jirovecii. Etude preliminaire

 G. Divaret, D.Magne, Adela Angoulvant, Patricia Roux

 Service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Saint-Antoine (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie, Paris

patricia.roux@sat.aphp.fr

 La pneumocystose est l’une des infections opportunistes les plus fréquentes tant chez les patients infectés par le VIH que chez les autres immunodéprimés (greffés, hémopathies…).

Le diagnostic est habituellement porté par la mise en évidence des différentes formes morphologiques de Pneumocystis jirovecii après colorations dans le lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA) ou  l’expectoration induite (EI).

Les (1,3)-ß-D-Glucanes sont des composants majeurs de la paroi des champignons, et sont présents dans la paroi des kystes de Pneumocystis jirovecii.

Le test Fungitell Associates of Cape Cod permet la détection des (1,3)-ß-D-glucanes dans le sérum. Il a été démontré que les (1,3)-ß-D-Glucanes sont détectables à des taux élevés dans le sérum de patients atteints de pneumonie à Pneumocystis jirovecii.

 Nous avons étudié rétrospectivement la concentration en (1,3)-ß-D-Glucanes sur 20 sérums itératifs prélevés chez 4 patients diagnostiqués et traités pour  une pneumocystose.

Les sérums étaient prélevés de J-22 à J120 par rapport à la date du diagnostic. Tous les sérums étaient positifs en (1,3)-ß-D-Glucanes (≥80 pg/ml). Une diminution de la concentration sérique en (1,3)-ß-D-Glucanes est observée au cours du temps mais celle ci reste élevée, >500 pg/ml, pendant les 15  premiers jours. Une positivité est également observée dans un  sérum  prélevé   précocément  (J-22)  et sur des échantillons prélevés tardivement (J55,85,120).

 Bien que les (1,3)-ß-D-Glucanes sériques tendent à diminuer après la mise en place d’un traitement leur dosage ne semble pas contributif pour le suivi d’une pneumocystose.

Ils apparaissent  très tôt au cours l’infection à Pneumocystis jirovecii.

Ces résultats préliminaires doivent être validés sur un plus grand nombre de cas.

 Evaluation de la PCR en temps réel dans le serum pour le diagnostic de l’Aspergillose Invasive chez les patients ayant eu au moins un dosage d’antigène galactomannane positif au CHRU de Marseille

 Ranque Stéphane^α, Mary Charles^α, Hafni Abdelmajid^α, Berger Pierre^β, Forel Jean-Marie ^γ, Galambrun Claire^δ, Michel-Nguyen Annie ^α, Dumon Henri ^α

 α Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU Timone Adultes ; β Institiut Paoli Calmettes, Centre National de Lutte contre le Cancer ; γ Département d’Anesthésie-Réanimation, CHU Sud Sainte Marguerite ; δ Service d’Onco-Hématologie, CHU Timone Enfants ; Marseille, France

 Le diagnostic d’Aspergillose Invasive est difficile. Des travaux d’autres équipes ont suggéré que la PCR dans le sérum, associée au dosage de antigénémie galactomannane, en améliore la performance. Nous avons voulu vérifier cette hypothèse dans la population de patients du CHRU de Marseille.

 Nous avons recherché la présence d’ADN d’Aspergillus spp. par une technique de PCR en temps-réel dans le premier sérum positif (index > 1) de tous les patients ayant eu au moins une antigénémie galactomannane positive au cours de l’année 2005.

 En tout, 74 patients hospitalisés dans un service d’Onco-Hématologie ou un service de Réanimation médicale ont été inclus. Sur 12 patients satisfaisant aux critères d’Aspergillose Invasive (9 Probable et 3 Possible) selon l’EORTC, la PCR-Aspergillus n’a été positive que dans un seul cas ; donnant une sensibilité de 8% et une spécificité de 85%.

 Cette technique de PCR-Aspergillus dans le sérum n’apporte aucun bénéfice significatif en terme de sensibilité et de rapidité pour le diagnostic de l’Aspergillose Invasive dans cette population. Nous envisageons d’étudier la performance de cette PCR sur des échantillons (LBA, biopsie) prélevés au site de l’infection.

AMELIORATION DU DIAGNOSTIC PRECOCE D’ASPERGILLOSE INVASIVE CHEZ LES PATIENTS À HAUT RISQUE EN ONCO-HEMATOLOGIE PAR L’UTILISATION D’UNE RT-PCR REALISEE SUR UN LARGE VOLUME DE SERUM

 

Felipe SUAREZ¹, Olivier LORTHOLARY², Stéphanie BULAND³, David GHEZ¹, Patrick BERCHE³, Marie-Elisabeth. BOUGNOUX³.

Service d’Hématologie adulte¹, Service de Maladies Infectieuses et Tropicales², Laboratoire de Bactériologie, Virologie, Parasitologie et Hygiène³. Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, France.

 Introduction. La détection d’antigène circulant galactomannane (GM) est le seul marqueur sérique recommandé par l’EORTC pour la surveillance des patients d’onco-hématologie à haut risque de développer une infection aspergillaire. La détection d’ADN de Aspergillus sp. dans le sérum pourrait aider à améliorer le diagnostic mais la sensibilité de la détection d’ADN est faible lorsque la PCR est réalisée sur un petit volume de sérum. Nous avons testé la sensibilité de la PCR lorsque celle-ci est réalisée après extraction d’un volume plus important de sérum.

 Méthodes. Au cours d’une étude prospective, nous avons comparé sur une période de 13 mois les performances de la détection bihebdomadaire de GM dans le sérum par ELISA (Platelia®, Aspergillus EIA, BioRad) et hebdomadaire d’ADN de Aspergillus fumigatus par RT-PCR après extraction de l’ADN par l’appareil MagNa pure LC (Roche Diagnostics) à partir d’un échantillon de 100µL (Kit III, Bacterial  Fungal) ou de 1mL (Kit-Large Volume) de sérum. Au total, 125 patients ont été inclus parmi lesquels 17 ont développé une aspergillose invasive (AI) (1 cas prouvé, 14 cas probables et 2 cas possibles).

 Résultats. La détection de GM a été effectuée sur 1902 sérums (détection bihebdomadaire). Le test a été considéré comme positif lorsque 2 sérums consécutifs avaient des index ≥ 0,5. La sensibilité (Se), la spécificité (Sp), la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) de la détection de GM pour le diagnostic d’AI étaient, respectivement, de 88,2%, 94,2%, 68,1%, et 98,2%. La détection d’ADN circulant par RT-PCR a été effectuée sur 925 sérums (détection hebdomadaire). L’extraction de l’ADN a été réalisée sur un volume de 1mL de sérum (large volume) sur l’ensemble des 925 sérums disponibles et sur un volume de 100µL sur 450 d’entre eux. Les Se, Sp, VPP, et VPN étaient, respectivement, de 100%, 96,6%, 81%, et 100% quand l’ADN était extrait à partir de 1 mL de sérum et de 64,7%, 99,1%, 91,7%, et 95,2% quand l’ADN était extrait à partir de 100µL de sérum. La RT-PCR large volume était positive plus précocement ou en même temps que le GM chez 13/17 patients atteints de AI et 2 à 7 jours plus tard chez les autres.

Conclusions. L’utilisation d’un large volume d’extraction de 1mL de sérum améliore significativement la sensibilité de la RT-PCR pour la détection d’ADN de A. fumigatus. Dans cette étude, les performances de la RT-PCR étaient supérieures à celles obtenues par détection bihebdomadaire de GM. Ces résultats montrent que la détection hebdomadaire d’ADN de Aspergillus sp. dans le sérum est un outil utile pour le diagnostic précoce des AI chez les patients à haut risque.

 Mécanismes moléculaires de Résistance à la caspofungine chez Candida albicans.

 C.Dunyach, S.Bertout, P.Drakulovski, D.Castel, M.Mallié

UMR 145 VIH et maladies associées, IRD/UM1

Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale, UFR de Pharmacie, 15 avenue Charles Flahaut, 34093 Montpellier.

 Objectif

L’objectif de ce travail est d’étudier l’influence d’une pression de sélection exercée par la caspofungine sur le génome d’une souche sensible de référence de Candida albicans.

Méthodes :

Une souche de référence (ATCC 90028) notée R a été soumise dans le temps à des concentrations croissantes de caspofungine allant de 0,5µg/ml à 8µg/ml. Entre chaque palier, la souche a été maintenue à une concentration constante pendant 3 cycles de reproduction de 48h. Une souche (R*) de CMI (concentration minimale inhibitrice) élevée a été obtenue. La souche de référence (R) et la souche R* ont été étudiées en parallèle. Sept gènes (CAN, GSL22, CRH11, ERG5, PGA3, RTA, SKN) ayant été décrits dans la littérature comme ayant un rôle dans le mécanisme d’action de la caspofungine ont été étudiés. Ces gènes ont été clonés, purifiés et séquencés à partir des génomes des deux souches R et R*.

Le but du séquençage est de mettre en évidence des mutations potentielles entre la souche R et la souche R*. Une comparaison de séquence par alignement a été réalisée entre les bases de données, la souche de référence et la souche R*.

Résultats obtenus :

La souche R* qui présente une CMI supérieure à 16µg/ml a été obtenue à partir de la souche de référence après 42 cycles de reproduction. L’étude des sept gènes sélectionnés a permis de mettre en évidence des mutations au niveau du gène GSL22 codant pour la FKS1p, sous-unité de la β-(1,3)-glucane synthase, cible d’action de la caspofungine et au niveau du gène CRH11 codant pour une protéine de la paroi cellulaire. Les autres gènes n’ayant présenté aucune mutation.

 Conclusion :

En conclusion, le but de ce travail est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition de résistance à la Caspofungine. De nouvelles investigations devront donc être réalisées afin de confirmer l’influence de ces mutations sur la diminution de la sensibilité à la caspofungine.

 Suivi de l'Index de Colonisation Corrigé et des Candidoses profondes en Réanimation Médicale

J.Y Mootien (1) ; MF Penner (2) ; X Delabranche (1) ; L Pinto (1) ; C Ionescu (1) ; M Geny (1) ; P Guiot (1).

(1)Service de Réanimation Médicale,CH Mulhouse;(2) Laboratoire de Microbiologie CH Mulhouse

 Objectifs

La colonisation préalable de la muqueuse à Candida spp. est un des facteurs de risques majeurs de  développement d’une candidose profonde. Le degré de colonisation peut être évalué par le calcul d’un index de colonisation corrigé (ICC) (1). Certains auteurs ont démontré la valeur prédictive de la colonisation fongique dans la survenue d’une candidémie et l’efficacité d’un traitement préemptif chez les patients chirurgicaux colonisés (2). Ceci a été peu évalué en réanimation médicale.

Matériel et méthodes

Nous avons évalué l’ICC chez les patients dont la durée d’hospitalisation prévisible à l’admission était de plus de 5 jours au sein d’un service de réanimation médicale de 20 lits pendant 14 mois. Un suivi de l’ICC était effectué dès l’admission et de façon hebdomadaire jusqu'à la sortie avec 5 prélèvements (pharynx, aspirations trachéales, liquide gastrique, urines et rectum). Les résultats n’ont été communiqués aux réanimateurs qu'à l'issue de cette phase d’observation et aucun traitement antifongique préemptif n'avait été administré. Par ailleurs les résultats de tout autre prélèvement  à visée diagnostique restaient accessibles aux cliniciens.

 Résultats

Deux cent quatre patients, 32% des admissions, (âge : 63±16, IGS : 53±19) ont été inclus. L'ICC était supérieur ou égal à 0,4 chez 73 patients (37%). Parmi ces patients 90% étaient admis pour une cause médicale et 90% ventilés. Un cathéter veineux central était en place chez 90% des patients et 20% avaient bénéficié d’une nutrition parentérale totale. Une antibiothérapie à large spectre avait été administrée chez 88 % des patients. Candida albicans  représente  plus de  deux tiers des souches isolées. Deux candidémies ont été diagnostiquées  pendant cette période. Un des 2 patients avait un ICC≥0,4.

Conclusions

Dans notre série de patients (ICC ≥ 0,4 dans 37% des cas), l'incidence des candidoses profondes reste  faible. L'instauration d' un traitement préemptif basé sur l'ICC, efficace sur des patients de chirurgie abdominale et polytraumatisés(2), ne semble pas justifié chez nos patients (recrutement essentiellement d'ordre médical). Par ailleurs  notre  écologie fongique étant principalement constituée de C.albicans, l'instauration d'un traitement empirique par fluconazole peut être réalisée dans certaines situations. Cette étude nécessite d'être confirmée par une population plus importante

 1.Pittet D, Monod M, Sutter PM, et al: Candida colonization and subsequent infections in critically ill surgical patients. Ann Surg 1994;220:751-8

2 Piarroux R, Grenouillet F, Balvay P, Tran V, Blasco G, Millon L, Boillot A: Assessment of preemptive treatment to prevent severe candidiasis in critically ill surgical patients. Crit Care Med 2004; 32:2443-9.

efficacite de la micafungine dans les infections à candida

Bertrand Dupont

 Résumé en attente

anidulafungine : une nouvelle echinocandine

Renée Grillot 

Résumé en attente
 

Résumés des communications affichées

Identification des levures : expérience de l’utilisation du VITEK au CHU de Poitiers

 Cateau Estelle, Bousseau Anne, Kauffmann-Lacroix Catherine, Mayet Dominique, Rodier Marie-Helene

 Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale, CHU de Poitiers, 2 rue de la Milétrie, BP 577, 86021 Poitiers Cedex. c.lacroix@chu-poitiers

 Objectifs : Nous avons souhaité évaluer la capacité du Vitek 2 YST (BioMérieux) à identifier les souches de levures issues des prélèvements de patients. Cette technique, plus rapide que l’identification à l’aide de la galerie de référence API 32C (BioMérieux), permet de fournir un résultat en 18h au clinicien. Il s’agit d’une étude rétrospective sur cinq mois.

 Méthodes : Au laboratoire, l’identification des levures se fait selon un arbre décisionnel et consiste en un test bichrolatex (C.albicans). Les prélèvements de bouche, gorge, selles et LBA sont ensemencés sur milieu chromogène permettant l’identification directe des colonies bleues en C. albicans. Si l’identification de l’espèce albicans est négative, un test RTT Glabrata est réalisé, si celui-ci est négatif nous réalisons une galerie Vitek 2 YST. En l’absence de résultats satisfaisants au Vitek 2, une galerie API 32C est effectuée.

 Résultats : Sur la période du 7 mai 2007 au 2 octobre 2007, 841 identifications de levures ont été pratiquées. 87% des souches sont identifiées grâce à des tests rapides (milieu chromogène, bichrolatex albicans, RTT Glabrata et/ou Krusei color). 13% des souches ont été identifiées grâce à l’utilisation de galeries correspondant à 112 galeries Vitek 2. Ces galeries nous ont permis d’obtenir une identification satisfaisante dans 72% des cas. Dans les autres cas, l’identification obtenue en galerie API 32C s’est révélée satisfaisante dans la majorité des cas.

 Conclusion : L’identification par Vitek, deux fois plus rapide que celle par galerie API 32C, a donné satisfaction dans presque 80% des cas. Dans 20% des cas, il a été nécessaire de mettre en œuvre une technique de confirmation. Le choix de la technique est donc orienté par la question suivante : faut-il privilégier l’exactitude ou bien la rapidité d’identification ? Nous avons souhaité privilégier l’identification précise de l’espèce et revenons à la galerie API 32C seule.

 

PNEUMOCYSTOSE A Pneumocystis jiroveci :

 ETUDE COMPAREE DE LA PCR ET DES TECHNIQUES DE COLORATION

 

Kaouech Emira¹, Kallel Kalthoum¹, Belhadj S.¹, Anane Sonia¹, Ben Chaabane T.², Chaker Emna¹.

                            

1-  Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU La Rabta, Tunis, Tunisie.

2- Service des maladies infectieuses, CHU La Rabta, Tunis, Tunisie.

     e-mail : emna.chaker@rns.tn

 

La  pneumocystose est une mycose opportuniste responsable de pneumopathie interstitielle grave chez les sujets immunodéprimés infectés ou non par le VIH.

Son diagnostic est posé devant l’aspect clinique et radiologique, et affirmé par la mise en évidence des trophozoïtes et/ou des kystes de Pneumocystis jiroveci  par de nombreuses techniques de coloration (Gomori-Grocott, May-Grünwald Giemsa, bleu de toluidine O).

De plus, de nombreuses techniques PCR ont été élaborées ces dernières années pour compléter le diagnostic mycologique classique.

Notre travail a comparé de façon prospective deux techniques de coloration (Gomori-Grocott et May-Grünwald Giemsa) à une technique PCR moyennant le couple d’amorces JKK 14 et JKK 17 amplifiant une séquence de 249 pb du gène de la glycoprotéine de surface de P. jiroveci.

Durant la période allant de Avril 2005 à Décembre 2006, nous avons colligé 53 prélèvements bronchopulmonaires (39 lavages bronchoalvéolaires, 8 crachats et 6 prélèvements trachéaux protégés) collectés de 49 patients immunodéprimés (SIDA et autres pathologies) atteints de pneumopathies interstitielles.

Parmi les prélèvements, 20 étaient positifs par la PCR soit 37,7% des échantillons contre 3 par les techniques de coloration soit 5,7%.

Ainsi, la technique PCR trouve son intérêt dans la confirmation du diagnostic   dans le cas des prélèvements difficiles à interpréter à l’examen direct.

Un séquençage confirmerait encore plus la présence du champignon chez nos malades.

CINETIQUE sérique deS  (1,3)-ß-D-Glucanes AU COURS DE LA pneumonie à Pneumocystis jirovecii. Etude preliminaire

G. Divaret, D.Magne, Adela Angoulvant, Patricia Roux

 Service de Parasitologie Mycologie, Hôpital Saint-Antoine (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie, Paris

patricia.roux@sat.aphp.fr

La pneumocystose est l’une des infections opportunistes les plus fréquentes tant chez les patients infectés par le VIH que chez les autres immunodéprimés (greffés, hémopathies…).

Le diagnostic est habituellement porté par la mise en évidence des différentes formes morphologiques de Pneumocystis jirovecii après colorations dans le lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA) ou  l’expectoration induite (EI).

Les (1,3)-ß-D-Glucanes sont des composants majeurs de la paroi des champignons, et sont présents dans la paroi des kystes de Pneumocystis jirovecii.

Le test Fungitell Associates of Cape Cod permet la détection des (1,3)-ß-D-glucanes dans le sérum. Il a été démontré que les (1,3)-ß-D-Glucanes sont détectables à des taux élevés dans le sérum de patients atteints de pneumonie à Pneumocystis jirovecii.

 Nous avons étudié rétrospectivement la concentration en (1,3)-ß-D-Glucanes sur 20 sérums itératifs prélevés chez 4 patients diagnostiqués et traités pour  une pneumocystose.

Les sérums étaient prélevés de J-22 à J120 par rapport à la date du diagnostic. Tous les sérums étaient positifs en (1,3)-ß-D-Glucanes (≥80 pg/ml). Une diminution de la concentration sérique en (1,3)-ß-D-Glucanes est observée au cours du temps mais celle ci reste élevée, >500 pg/ml, pendant les 15  premiers jours. Une positivité est également observée dans un  sérum  prélevé   précocément  (J-22)  et sur des échantillons prélevés tardivement (J55,85,120).

Bien que les (1,3)-ß-D-Glucanes sériques tendent à diminuer après la mise en place d’un traitement leur dosage ne semble pas contributif pour le suivi d’une pneumocystose.

Ils apparaissent  très tôt au cours l’infection à Pneumocystis jirovecii.

Ces résultats préliminaires doivent être validés sur un plus grand nombre de cas.

PCR quantitative en temps réel pour le diagnostic

et le suivi non invasifs  de la pneumocystose

Patricia Roux¹, Adela Angoulvant¹, Marie Giselle Lebrette², Pierre-Marie Girard³,  Eric Maury⁴,  Denis Magne¹

1-Service de parasitologie-Mycologie,3-Service  des Maladies Infectieuses et Tropicales, 4- Service de Réanimation Médicale  Hôpital Saint Antoine , Paris

1-2 - Service  des Maladies Infectieuses et Tropicales, Hôpital  Tenon, Paris

1-patricia.roux@sat.aphp.fr

 La pneumocystose (PCP) est une des infections opportunistes les plus fréquentes chez les patients atteints de sida ou d'autres immunodépressions. Le diagnostic, suspecté cliniquement, est confirmé   par la mise en évidence des différentes formes morphologiques de  Pneumocystis jirovecii (PJ) dans le lavage bronchiolo alvéolaire (LBA)  par différentes colorations standards ou par l'utilisation d'anticorps monoclonaux  (Monofluokit Pneumocystis jirovecii, Biorad, Marnes la Coquette,France). De nombreuses études ont démontré une sensibilité supérieure de la PCR pour la détection de Pneumocystis.

Le but de cette étude était de déterminer si la PCR quantitative en temps réel pouvait être utilisée pour le diagnostic  de pneumocystose et son suivi dans des prélèvements non invasifs tels que des rinçages oro-pharyngés (ROP) ou des expectorations induites (EI).:  Nous avons mené une étude prospective chez 27 patients HIV+ ayant présenté une pneumocystose confirmée biologiquement. Cinquante neuf prélèvements ont été effectués entre J0 et J40 du diagnostic: LBA (n=42), EI (n=9), ROP (n=8). L'ADN de PJ a été recherché par PCR quantitative en temps réel   (Taqman® technologie , ABI Prism 7700, Applied Biosystem) amplifiant le gène  de la grande sous unité  d'ARN ribosomale mitochondriale (mtLSUr RNA). Un échantillon est considéré comme étant négatif si aucun signal n'est détecté au bout de 40 cycles (CT>40). Parmi les 27 patients, 21 ont eu un LBA, 6 une EI en première intention pour le diagnostic. Tous les patients ont eu un second prélèvement: LBA (n=19), ROP (n=6), EI (n=1) réalisé entre J0 et J20. Cinq patients ont eu de 3 à 5 prélèvements entre J14 et J40.

 Résultats: L'ADN de PJ a été détecté à J0 dans les EI (CT=23-30, moyenne=27), les LBA (CT=12-30, moyenne=23). Sept ROP, prélevés entre J0 et J8 était positifs (moyenne CT=27), 1 ROP était négatif à J11.

Conclusions: La PCR quantitative en temps réel peut être utilisée dans des prélèvements non invasifs  tels que les EI et les ROP pour le diagnostic et le suivi de la pneumocystose.

Etude de la sensibilité de 43 souches de Candida albicans à 8 molécules antifongiques. Efficacité comparée de 2 techniques d’évaluation : Sensititre YeastOne® vs. CLSI M27A2.

C.Dunyach,  S.Bertout, P.Drakulovski, D.Castel, M.Mallié

UMR 145 VIH et Maladies associées, IRD/UM1

Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Médicale, UFR de Pharmacie, 15 avenue Charles Flahaut, 34093 Montpellier.

 But de l’étude :

L’incidence des infections fongiques sévères a augmenté considérablement durant ces vingt dernières années. Ceci est principalement du au nombre croissant de patients immunodéprimés (patients atteints de cancer, transplantées d’organes ou de moelle osseuse, patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine). Les levures du genre Candida, souvent impliquées dans ce type d’infection, peuvent être responsables de mycoses superficielles ou systémiques. Il a été démontré qu’on observait une augmentation du phénomène de résistance aux azolés sur certaines souches de Candida, due notamment à la large utilisation de ces antifongiques en monothérapie. Il semble donc nécessaire de disposer d’un test rapide et fiable permettant d’évaluer la sensibilité de ce champignon à divers antifongiques. C’est pourquoi le but de cette étude est de comparer les performances de 2 tests d’évaluation de la sensibilité aux antifongiques, une technique de référence décrite par le CLSI et un test nouvellement commercialisé en France, le Sensititre YeastOne®.

Matériel et méthodes :

La sensibilité de 43 souches de Candida albicans à 8 antifongiques (fluconazole, posaconazole, voriconazole, itraconazole, kétoconazole, flucytosine, amphotéricine B, caspofungine) est évaluée conjointement par deux microméthodes de dilution en milieu liquide (CLSI M27A2 et Sensititre YeastOne®). Les résultats sont lus après 24h et 48h d’incubation à 35°C comme recommandé pour les isolats de Candida.

Resultats :

Les pourcentages d’agrément sont déterminés dans un intervalle de ± 2 dilutions.

Pour les 43 souches étudiées, les pourcentages de corrélation à 24h sont de 68%, 93%, 77%, 74%, 83%, 74%, 63% et 86% pour le fluconazole, le posaconazole, la flucytosine ,le kétoconazole l’amphotéricine B, l’itraconazole le voriconazole et la caspofungine respectivement. Les pourcentages de corrélation obtenus à 48h sont moins élevés exceptés dans le cas de la 5-FC. En effet, les résultats lus à 48h sont faussés par l’apparition des effets de traîne déjà décrits dans le cas des azolés. Ces effets de traîne sont cependant beaucoup moins fréquents par la méthode de Sensititre® que par la méthode M27A2 du CLSI. Les résultats obtenus pour la caspofungine à 48h sont également faussés par un effet paradoxal qui se caractérise par le fait que la caspofungine est plus efficace in vitro à 48h à de faibles concentrations qu’à des concentrations supérieures à 4µg/ml. Les résultats obtenus sont en adéquation avec les résultats obtenus avec la méthode de sensibilté ATB-fungus 2®.

Conclusions:

Cette étude a montré une bonne corrélation entre les 2 techniques testées pour le posaconazole, la flucytosine, l’amphotéricine B et la caspofungine. Concernant le fluconazole, le kétoconazole, l’Itraconazole et le voriconazole, le pourcentage d’agrément est faible entre les 2 méthodes (de 63% à 74% à 24h). Cependant les méthodes utilisées permettent de classer les souches dans la même catégorie (sensible, SDD ou résistante) dans plus de 75% des cas. C’est pourquoi nous pouvons conclure que le Sensititre ® est une bonne technique pour évaluer la sensibilité des souches de Candida en routine.

 Concentrations Minimales Inhibitrices de six antifongiques Sur Les Aspergillus spP. isolés de patients AU CHRU de Marseille

 GLASMAN Laurence^α, Michel-Nguyen Annie^α, Reynaud-Gaubert Martine^δ,
Dubus Jean-Christophe^β, Dumon Henri^α, Ranque Stéphane^α

α Laboratoire de Parasitologie-Mycologie ; β Centre de Ressources et de Compétences de la Mucoviscidose (CRCM) pédiatrique, CHU Timone ; δ CRCM adultes, Service de Pneumologie, CHU Sud Sainte Marguerite ; Marseille, France

Le nombre d’Aspergillus spp. isolés au laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU de Marseille a augmenté significativement au cours de ces dernières années. En particulier chez les patients atteints de mucoviscidose et/ou greffés pulmonaires. Nous avons poursuivi la comparaison des profils de susceptibilité aux antifongiques de ces Aspergillus spp. , provenant essentiellement de prélèvements des voies respiratoires, commencée le 1^er janvier 2006. Aux antifongiques initialement testés : la 5-fluorocytosine, l’amphotéricine B, l’itraconazole, le voriconazole, ont été ajoutés la caspofungine et le posaconazole.

Les isolats ont été identifiés par leurs caractères morphologiques. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été déterminées à l’aide de bandelettes Etest^â (AB Biodisk, Stockholm, Suède) après 48 à 72 heures de culture sur des milieux RPMI (AES, France) à 30°C. Entre le 10 février 2007 et le 1^er octobre 2007, les CMI ont été déterminées pour 366 isolats, émanant de 214 patients. Cinq espèces étaient majoritaires : A. fumigatus, 50% ; A. niger, 19% ; A. terreus, 9% ; A. flavus, 8% ; A. versicolor,7%  et d’autres plus rares : A.  nidulans, A. ochraceus, A. flavipes, A. candidus, A. glaucus, A. restrictus, et A. sydowi, soit en tout 7% des isolats.

 

Le niveau de résistance in vitro varie selon les espèces et les antifongiques. Il est à noter que la majorité des isolats d’A. fumigatus, A. niger, A. terreus, et A. flavus, espèces les plus fréquemment trouvées chez nos patients, ont une CMI relativement basse (<1 mg/l) pour les nouveaux antifongiques : voriconazole, posaconazole et caspofungine. Un phénomène de repousse, similaire à l’effet de traîne connu pour les azolés, et/ou de croissance paradoxale à des concentrations élevées a souvent été constaté pour la caspofungine.

Evaluation d’une trousse ELISA (IgG) Sérion pour le dépistage des anticorps anti aspergillaires chez les patients atteints de mucoviscidose.

R Trofin*, Cathy Llerena**, Bérengère Coltey**, H Pelloux*, Renée Grillot*, Claudine Pinel*

Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, Département des agents infectieux (DAI),

** Département de Pédiatrie, CHU Albert Michallon, BP 217, 38043 Grenoble Cedex 9.

Chez les patients atteints de mucoviscidose, l’infection bactérienne chronique de la sphère pulmonaire associée aux difficultés d’éliminer les mucosités facilite la colonisation aspergillaire. Celle-ci, peut alors évoluer progressivement en aspergillose clinique. La forme la plus commune dans ce contexte très particulier est l’aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) mettant en jeu des mécanismes d’hypersensibilité de type I et III. Le diagnostic est toujours délicat et s’appuie sur un faisceau d’arguments radiologiques, cliniques et biologiques. Parmi les critères du diagnostic de l’ABPA, la présence de précipitines anti aspergillaires ainsi que le taux d’IgG spécifiques sont des éléments à prendre en compte dans le diagnostic de cette forme clinique d’aspergillose Cependant, la mise en évidence des anticorps précipitants bien que plus fortement corrélée à l’infection aspergillaire, est techniquement longue et dispendieuse en sérum et en temps et s’effectue généralement dans un cadre de confirmation de positivité de la méthode de dépistage.    

Aussi nous avons évalué la valeur dans le dépistage quantitatif des anticorps anti  aspergillaires d’une méthode ELISA (IgG) Sérion en suivi prospectif en parallèle avec la  technique ELISA (IgG) mise au point au laboratoire et effectuée depuis de nombreuses années dans le suivi sérologique des patients.

Parmi les 259 sérums (197 patients) suivis en parallèle au cours de cette étude, nous avons plus particulièrement évalué l’intérêt de cette trousse chez les patients atteints de mucoviscidose (28 patients : 44 sérums). Sept des ces patients ont eu des épisodes antérieurs ou récents d’ABPA et un patient, greffé pulmonaire, a développé une surinfection aspergillaire post greffe.

Le protocole d’utilisation de cette trousse est effectué conformément aux conditions établies par le fabricant. Les densités optiques sont transcrites sur une base de données fournie par le fabricant permettant de transformer les DO en unités arbitraires par ml en tenant compte des valeurs du témoin positif. Le seuil de spécificité est fixé à 70 unités/ml, le test est négatif au dessous de 50 unités et équivoque entre 50 et 70 unités/ml.

Dans le cas des patients atteints de mucoviscidose, les précipitines sont présentes dans 80% des sérums positifs en ELISA Sérion. De même, les anticorps précipitants sont absents ou en quantité non significative dans 83% des sérums équivoques ou négatifs en ELISA. La sensibilité inférieure à celle de l’ELISA du laboratoire est compensée par une intéressante spécificité assurant une valeur prédictive négative de 92%. Deux  discordances majeures seront discutées en fonction de l’évolution clinique des patients.

Il est impératif de disposer d’une technique de dépistage non systématiquement positive lors de simple colonisation aspergillaire. Dans ce contexte, l’ELISA (IgG) Sérion, par sa spécificité et sa très bonne reproductibilité pourrait être une méthode tout à fait applicable au suivi sérologique des patients atteints de mucoviscidose.

Vagner

 Résumé en attente
 

CARACTERISATION MOLECULAIRE DES PROTOTHECA ISOLEES DE CAS DE MAMMITE BOVINE.

A. AOUAY ¹, Alexandra BELAYEW ¹, Pascale CUVELIER ², P-E LAGNEAU ², C. MULLENDER ².

¹ Université de Mons-Hainaut, Laboratoire de Biologie Moléculaire. Avenue du Champ de Mars. Mons, Belgique.

² Association Régionale de Santé et d’Identification Animales. Drève du Prophète, 2, Mons, Belgique.

 Introduction :

Prototheca zopfii est une algue achlorophylle dont l’importance en médecine vétérinaire réside essentiellement dans son association à la mammite bovine. Roesler et al., 2006 (1) ont proposé récemment une méthode de diagnostic des Prototheca par PCR-RFLP dans laquelle l’analyse du gène de l’ARN ribosomal 18S permet de distinguer trois génotypes différents. Le but de ce travail est de réaliser ces tests à partir de 25 souches de Prototheca zopfii et de soumettre également 3 souches ne correspondant pas aux critères d’identification de l’espèce « zopfii» (2). Elles proviennent toutes de cas de mammite bovine et sont issues d’exploitations différentes de Belgique et de France.

Matériel et Méthodes :

Nous avons cultivé les Prototheca sur milieu de Sabouraud. Ensuite, l’extraction de l’ADN génomique est réalisée au moyen du kit Qiagen (Dneasy ® Plant Mini kit). Les fragments d’ADNr 18S des différentes souches sont amplifiés par PCR avec des amorces spécifiques. Nous avons utilisé les amorces proposées par Roesler et al., 2006 mais en inversant l’orientation 5’- 3’ erronée, suite à une erreur d’impression dans la publication. Les RFLP sont mis en évidence avec trois enzymes de restriction différentes sur les produits amplifiés : les fragments obtenus avec le couple d’amorces proto 18-2f/2r sont digérés par Smal et Kpn21 et les fragments obtenus avec le couple d’amorces proto 18-4f/4r sont digérés par Bcn1. Les produits de la digestion enzymatique sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose et révélés par une coloration au bromure d’éthidium.

Résultats :

Sur les 28 souches de Prototheca, nous avons identifié par PCR-RFLP, 25 souches digérées par Smal correspondant à P. zopfii génotype II, les 3 souches atypiques digérées par Bcn1 correspondent à l’espèce zopfii génotype III. Au cours de cette étude, nous n’avons pas détecté de souches digérées par Kpn21 qui correspondraient au génotype I.

Conclusion :

A partir des souches de Prototheca provenant toutes de lait mammiteux, l’approche de Roesler et al., 2006 nous a permis d’identifier deux génotypes différents. La mammite bovine est causée majoritairement par P. zopfii génotype II. Toutefois, à côté de ce génotype pathogène, nous soulignons l’intérêt de surveiller l’isolement du génotype III ou P. blaschkae lors de cas de mastite bovine. A ce jour, aucun auteur n’a encore mentionné l’isolement du génotype I en pathologie mammaire. L’approche moléculaire de l’identification des Prototheca permet d’obtenir rapidement un résultat fiable et est particulièrement adaptée à l’étude épidémiologique. Ce travail permet d’envisager un diagnostic précoce sur l’ADN extrait dès la réception des laits au laboratoire 

1 : Roesler et al. Diversity within the current algal species Prototheca zopfii : a proposal for two Prototheca zopfii genotypes and description of a novel species, Prototheca blaschkae sp. nov. Inst. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006;56:1419-1425.

2 : Lagneau P-E., Chapon S.  La mammite bovine à Prototheca zopfii : à propos de deux souches atypiques. Congrès de la Société Française de Mycologie Médicale. Lyon.15-16 mai 2006. Abstract p. 33.

Etude de la colonisation en moisissures des instruments à vent à anche et des conséquences cliniques et immunologiques chez les musiciens

 Vacheyrou Mallory¹, Metzger Flora², Reboux G. ¹, Lefebvre Annick ², Roussel Sandrine¹, Grenouillet F.¹, Thaon Isabelle³, Dalphin J-C ²

 (1) Université de Franche-Comté (Santé Environnement Rural Franche-Comté, EA 2276) et Laboratoire de Mycologie CHU de Besançon,  mallory.vacheyrou@univ-fcomte.fr

(2) Service de Pneumologie CHU de Besançon

(3) Médecine du travail et maladies professionnelles CHU de Besançon

 Deux cas de pneumopathies d’hypersensibilités (PHS) ou de pneumopathie interstitielle non spécifique (PINS) ont été observés chez un saxophoniste en Belgique et une hautboïste en Franche-Comté. L’inhalation de moisissures présentes dans les instruments de musique a été suspectée comme pouvant être à l’origine de ces pathologies.

 Afin de connaître la nature de la colonisation en moisissures des instruments, et les conséquences cliniques et immunologiques chez les musiciens, une étude épidémiologique a été menée. Quarante musiciens pratiquant un instrument à vent à anche (15 saxophones, 13 clarinettes, 5 hautbois, 7 bassons) ont été recrutés. Un examen clinique, des prélèvements mycologiques (instrument et lavage buccal) et une recherche de précipitines en double diffusion et électrosynérèse vis-à-vis de 6 espèces fongiques isolées, incluant Candida albicans, ont été réalisées.

 La majorité des instruments étaient colonisée par un ou plusieurs champignons, principalement: Rhodotorula mucilaginosa, Penicillium spp. (majoritairement P. chrysogenum et P. citrinum), Phoma glomerata, Eurotium amstelodami, Candida parapsilosis et Fusarium oxysporum.

 Vingt cinq questions portant notamment sur la durée d’utilisation et sur l’entretien des instruments ont été posées. Elles ont permis de mettre en évidence une utilisation de 6 h 48 en moyenne par semaine (1 à 42 h/semaine) et le développement de champignons lié à l’entretien : l’absence de séchage systématique favorise la colonisation par les levures blanches (p<0,01), l’utilisation d’eau pour tremper l’anche accroît le développement de P. glomerata (p=0,01) et F. oxysporum (p<0,05).

 Les analyses sérologiques n’ont pas montré de différence significative de la sensibilisation entre les musiciens et une population témoin. Aucun cas de PHS ou de PINS n’a été détecté dans la population de musiciens recrutés.Les instruments de musique sont un milieu idéal (anche d’origine végétale, humidité, chaleur) pour la colonisation d’une flore fongique spécifique. Les espèces isolées dans les instruments ne représentent pas la flore fongique habituelle des logements en Franche-Comté. Les musiciens sont exposés de façon chronique, ce qui peux avoir des conséquences sur la santé, notamment au niveau respiratoire. Le risque réel de PHS ou PINS des musiciens par inhalation de champignons reste à évaluer. 

Caractérisation génomique et phénotypique des populations de micromycètes du genre Scedosporium

 GANTOIS Nausicaa¹, DEI-CAS Eduardo^1,2, DELAES Laurence^1,2

 ¹Ecologie du Parasitisme (EA 3609), Institut Pasteur de Lille, France,
 ² Service de Parasitologie- Mycologie au Centre de Biologie- Pathologie du CHRU de Lille, France

La dernière décennie a été marquée par des progrès considérables dans la prise en charge des patients atteints de mucoviscidose, allongeant significativement leur espérance de vie. Une meilleure gestion de la colonisation bactérienne à P. aeruginosa ainsi que des colonisations fongiques y a largement contribué. A. fumigatus est actuellement la 1^ère espèce fongique responsable de colonisation chronique et de tableau d'aspergillose broncho-pulmonaire allergique chez ces patients. Deux études ainsi que le travail de JP. Bouchara et al ont permis de placer le complexe P. boydii en tant que 2^ème agent. Cette colonisation fongique participe à la dégradation de la fonction respiratoire ainsi qu'à l'évolution vers la fibrose pulmonaire, stade ultime avant la greffe pulmonaire ou cardio-pulmonaire. Le complexe P. boydii a d'ailleurs était décrit comme responsable d'infections disséminées dans cette situation d'immunodépression post-greffe. Celles-ci sont particulièrement difficiles à traiter puisque ce genre est connu pour être peu sensible aux antifongiques.

Dans ce contexte, nous avons choisi d'étudier l'épidémiologie de Scedosporium spp au sein de la région Nord-Pas-de-Calais et de comparer ces isolats à ceux obtenus chez des patients de d'autres régions françaises ou isolés en Australie. Pour chacun des isolats, nous avons procédé à un examen phénotypique et génotypique. L'étude phénotypique reposait sur l'étude des caractères macroscopiques et microscopiques de nos isolats en culture et la détermination de leur sensibilité aux antifongiques par la méthode des E-Tests. L'étude génotypique a été réalisée au moyen de deux techniques de principes différents et complémentaires: les méthodes dites de "bar-coding" dont font partie les PCR-Fingerprinting utilisant les amorces M13 et GACA₄, et le séquençage ciblant des régions codantes (gène de la béta-tubuline) et non codantes (gènes ITS1/2).

Bien qu'appartenant tous au genre Scedosporium, nos isolats du complexe P. boydii se sont répartis en différents clades au sein du complexe, avec un isolat identifié comme S. aurantiacum, et ont montré une plus grande biodiversité que les isolats S. prolificans. L'étude de la sensibilité in vitro aux antifongiques de nos isolats nous a permis de constater que le voriconazole est bien l'une des molécules les plus actives in vitro à l'heure actuelle en cas de scédosporiose.

Au total, ces résultats ont permis de mettre en évidence une colonisation chronique à Scedosporium apiospermum chez certains de nos patients, de déceler la présence de S. aurantiacum dans un cas. Sa mise en évidence chez les patients atteints de mucoviscidose est très importante, déterminante dans la prise en charge du patient, puisque cette espèce récemment découverte est moins sensible aux antifongiques que les autres membres du complexe P. boydii. Ainsi, nos résultats soulignent l'importance du suivi mycologique régulier des patients atteints de mucoviscidose pour assurer une meilleure prévention de la dégradation de la fonction respiratoire et permettre une prise en charge rapide et adaptée.

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